分光光度法测定苹果果实总黄酮含量的条件优化.doc

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1、分光光度法测定苹果果实总黄酮含量的条件优化文献标识码： A 类黄酮是一类多酚化合物，具有抗菌、抗病毒、消炎、抗过 敏、扩张血管等生理功能。苹果果实富含类黄酮， Tsao 等对 8 个苹果品种进行了测定，类黄酮含量在834.22300.3mg?kg-1（果皮）和 15605.6mg?kg-1。（果肉）。类黄酮测 定方法是研究苹果果实类黄酮组成与含量的基础。 苹果果实类黄 酮的测定通常采用液相色谱法， 类黄酮经色谱柱分离后， 用相应 的标准品进行定性和定量。 但液相色谱法并不适于苹果果实总黄 酮含量的测定。究其原因，苹果果实中已报道的类黄酮超过 30 种，而多数类黄酮没有标准品。目前，苹果果实总黄

2、酮含量测定 报道甚少，均采用分光光度法，以硝酸铝为显色剂，以芦丁为标 准品，检测波长为500nm或510nm然而，笔者试验显示，该方 法用于苹果果实总黄酮含量测定存在较多缺陷， 检测条件有待系 统研究。为此，对标准品种类、显色剂种类、检测波长、环境温 度、显色反应体系中乙醇浓度等进行了筛选和优化， 旨在确定分 光光度法测定苹果果实总黄酮含量的适宜条件。1 材料和方法1.1 材料供试材料为富士、红星、金冠和国光苹果果实。购自水果超 市。1.2 方法1.2.1 样液制备 称取苹果果肉200 g,加入100mL8%乙 醇，匀浆3min。称取15g样品，加入30mL8C乙醇，漩涡混匀 0.5min ，

3、放置 3 h ，超声提取 30rain ，抽滤，滤渣再超声提取 2 次（每次加20mL80%乙醇），合并滤液，用80%乙醇定容至100mL 得果肉样液。削取苹果果皮（厚约1mm,冻干，粉碎。称取1g 样品，加入 30mL 80%乙醇，以下操作同“果肉样液的制备”， 得果皮样液。1.2.2 总黄酮含量测定 吸取1mL样液或标准溶液于10mL容量瓶中，加入5mL蒸馏水和0.3mL5%亚硝酸钠溶液，摇匀， 加人0.3mL 10%铝盐溶液，摇匀，放置 5min,加入2mL1mol?L-1 氢氧化钠溶液，摇匀，蒸馏水定容，测定500 nm吸光度（A500）。样品总黄酮含量以鲜质量计。1.2.3 测定条件

4、筛选与优化 分别吸取儿茶素、芦丁、槲 皮素和根皮苷溶液 （200 mg?L-1） ,以氯化铝为显色剂,按 1.2.2 操作，定容后进行200700mn波长扫描，确定适宜标准品。吸 取1mL200mg?L-仇茶素溶液或样液，分别以氯化铝、硝酸铝和 硫酸铝为显色剂，按1.2.2操作，定容后进行200-700nm波长扫 描，确定适宜显色剂。吸取 1mL200mg?L-1儿茶素溶液或样液， 以氯化铝为显色剂，按1.2.2操作，定容后在4C、25C或40C 环境温度下放置2h（其间。每隔20min测定1次A500），确定适 宜环境温度。反应体系设 8%和 50%2 种乙醇浓度,以氯化铝为 显色剂，按12

5、2操作（乙醇浓度为50%时，将“加入5mL蒸馏 水”改为“加入4.2mL无水乙醇”），确定反应体系适宜乙醇浓 度。以空样品池为参比，分别对试剂空白、样液和显色后样液进 行400600nm波长扫描。分析背景成分对测定结果的影响。1.2.4 方法学考察 用 80%乙醇配制 50、100、150、200、 250和 300 mg?L-1 儿茶素溶液，以氯化铝为显色剂，按 1.2.2 操作，测定A500,绘制标准曲线，确定适宜浓度范围。分别用 果肉和果皮制备样液，以氯化铝为显色剂，测定总黄酮含量，计 算相对标准偏差， 考察方法精密度。 分别在果皮和果肉中添加一 定量的儿茶素， 制备样液， 以氯化铝为显

6、色剂， 测定总黄酮含量， 计算添加回收率，考察方法准确度。2 结果与分析2.1 标准品的筛选儿茶素、芦丁、槲皮素、根皮苷等 4 种类黄酮标准品溶液显 色后进行波长扫描，结果见图 1。在紫外光谱区，除槲皮素和根 皮苷的第 2个吸收峰外。 其余吸收峰均过于尖锐， 以其最大吸收 波长为检测波长， 会使检测结果受波长误差影响大、 标准曲线线 性范围过窄； 槲皮素和根皮苷的第 2个吸收峰虽然不尖锐， 但峰 形不好、谱线不光滑，难以选择到适宜的检测波长。在可见光谱 区，根皮苷和槲皮素均无最大吸收峰；儿茶素和芦丁分别在 500 nm和510nm有一最大吸收峰，且2者峰形相似、谱线平滑。儿 茶素在500nm处

7、的响应值比相同浓度芦丁在 510 nm处的响应值高 0.4 倍多，表明儿茶素比芦丁更灵敏， 故选择儿茶素为标准品。Fawbush等在测定恩派苹果果实总黄酮含量时即以儿茶素为标准 品。2.2 显色剂的选择儿茶素溶液分别用氯化铝、 硝酸铝和硫酸铝显色后进行波长 扫捕，结果见图 2。从图 2 可见。3 条图谱不仅峰形一致，而且 几乎完全重叠。 新红星苹果的果皮提取液和果肉提取液分别用氯 化铝、硝酸铝和硫酸铝显色后进行波长扫描，所得图谱（ 本文未给出 ）与儿茶素溶液情况类似。这表明。在测定苹果果实总黄酮 含量时，氯化铝、硝酸铝和硫酸铝均可作显色剂，这与前人报道 相一致。2.3 检测波长的选择 应用分光

8、光度法进行测定时，为使测定结果有较高的灵敏 度，通常应选择被测物质溶液的最大吸收波长， 不仅吸光度值较 大，且受分析波长误差影响较小。 儿茶素溶液显色后在紫外光谱 区250nm和330mm各有一吸收峰，在可见光谱区有500nm吸收峰 （图3）。苹果果皮提取液和果肉提取液也有 3个吸收峰，且位置 与儿茶素极为接近， 但紫外光谱区的两个峰峰形与儿茶素差异很 大，表明果实提取液中类黄酮以外的其他成分对类黄酮吸收紫外 光有较强的干扰：可见光谱区的吸收峰峰形与儿茶素几乎完全一致，表明提取液中类黄酮以外的其他成分对类黄酮吸收可见 光影响不大，而且该峰较矮、较宽，采用其最大吸收波长为检测波长，标准曲线线性范

9、围大。因此，确定 500nm为测定苹果果实总黄酮含量检测波长。2.4 环境温度对显色稳定性的影响儿茶素溶液用氯化铝显色后，其 A500随放置时间延长而下 降，而且下降速度与环境温度有关，环境温度越高下降越快（ 图4）。显色定容后将溶液放置在 4 C环境温度下，A500下降缓慢， 平均每小时下降5.3 %。而将溶液放置在25C和40C环境温度 下，A500急速下降，平均每小时分别下降 33.5 %和43.5 %。苹 果果肉和果皮提取液与儿茶素溶液情况类似，但A500下降速度较慢，约为儿茶素溶液的 15。有鉴于此，为保证测定结果准 确，显色定容后的溶液最好放置在 4C的低温条件下，并尽快测 定其A

10、m用儿茶素溶液绘制标准曲线时尤其如此。2.5 显色反应体系中乙醇浓度的影响无论是苹果果肉还是果皮，显色反应体系中乙醇浓度为8%时的测定结果均明显高于乙醇浓度为 50%时的测定结果 （表 1）， 特别是果皮，前者比后者高 34.2%。试验还发现测定苹果果皮 总黄酮含量过程中，当乙醇浓度为 50%时，溶液显色后有大量 絮状沉淀出现。 在银杏叶、 竹叶和桑黄总黄酮含量测定时也发现 了类似问题， 这是杂质造成的， 杂质在碱性环境下与铝离子形成 络合物沉淀， 致使测定准确度和重现性变差。 将显色反应体系中 乙醇浓度降至 8%，避免了显色后沉淀的出现，而且比采用离心 或过滤的方法去除沉淀更加省时、高效，还

11、可降低测定成本。2.6 背景成分对测定的影响 采用分光光度法进行样品检测时， 参比溶液应包括除待测成 分以外的全部背景成分。 波长扫描图谱显示， 测定苹果果皮和果 肉总黄酮含量时， 试剂空白和未显色果实提取液对 400-600nm 可 见光均有一定程度的吸收 (图 5) 。应将其扣除，否则会对测定结 果产生干扰， 使测得的苹果果实总黄酮含量出现虚高现象。 以空 样品池为参比测定未显色果实提取液的500nm吸光度(A500),再以空白试剂为参比测定果实提取液显色后的 500 nm 吸光度 (A500)，2者之差(A500-A500)即为真实吸光度，以此计算果 实提取液的总黄酮浓度即可扣除背景成分

12、对测定的影响。2.7 方法的线性范围根据50-300mg?L-1儿茶素系列标准溶液显色后的A500绘制标准曲线，回归方程为 C=392.65A500-4.05，相关系数F。为 0.9998，可见儿茶素溶液浓度与 A500之间存在良好的线性关系。 应用分光光度法测定样品中某种成分的含量时， 一般应控制被测 试液的吸光度在 0.2-0.7 。由此推算。在进行苹果果实总黄酮含 量测定时， 样品提取液中类黄酮浓度最好控制在 75-270 mg?L-1， 低于75 mg?L-1o进行适当浓缩，高于270mg?L-1进行适当稀释。2.8 方法的准确度和精密度 用富士、红星、金冠和国光苹果果实进行方法准确度

13、试验和精密度试验。结果显示，果皮中添加 3 8046410mg?kg-1儿茶 素，回收率在100.8 %104.9 % :果肉中添加500 mg?kg-1或1000 mg?kg-1儿茶素，回收率在101.7 %105.0 % （表2）。果皮 重复样品的总黄酮含量相对标准偏差在0.5 %5.0 %，果肉重复样品的总黄酮含量相对标准偏差在 0.6% 1.8 %，均不超过 5%（ 表 3）。这表明，在优化后的条件下。苹果果实总黄酮含量 测定结果准确、重复性好。3 讨论苹果果实所含类黄酮种类相当多， 高效液相色谱法适于类黄 酮单体的测定， 但因标准品种类的限制， 该方法仅能测定其中 部分类黄酮， 而采

14、用分光光度法则可实现苹果果实总黄酮含量的 测定。芦丁溶液显色后其可见光谱区最大吸收波长为510nm并非报道的500nm采用儿茶素为标准品，灵敏度明显高于芦丁，而 且可见光谱区最大吸收波长是500nm（图1）。铝盐是分光光度法测定苹果果实总黄酮含量的显色剂， 铝离子与黄酮化合物形成稳 定的配合物。显色反应中分别加入氯化铝、 硝酸铝和硫酸铝， A500 几乎完全一致 （ 图 2） ，因此，选择其中任何一种铝盐作显色剂均 可。虽然有人采用 A500测定苹果果实总黄酮含量，但本研究表 明，可见光谱区的最大吸收峰并不在510nm而在500nm（图3）,这与王建华等旧的报道相一致。500nm吸收峰较矮、较

15、宽（图3）, 以500nm为检测波长，可获得较大的标准曲线线性范围。分光光度法测定总黄酮含量时， 显色定容后的环境温度对测 定结果有影响， 必要时应针对具体样品对其进行优选。 本文进行了对比研究，显色定容后的环境温度以4C为宜，溶液A500下降速度明显比环境温度为 25C和40C时慢，反映出显色反应生 成的红色配合物在低温条件下更为稳定。 采用分光光度法测定总 黄酮含量时， 显色反应体系中乙醇浓度不同。 实验结果差异很大 。本研究证明了这一现象，无论是苹果果皮还是果肉，乙醇浓 度为 8时的测定结果均明显好于乙醇浓度为 50时的测定结 果，而且高乙醇浓度条件下测定苹果果皮总黄酮含量时还会出现 明显的絮状沉淀。分光光度法具有应用范围广、灵敏度高、准确度好、操作简 便等优点。本研究结果反映了这些优点，在优化后的条件下，采 用分光光度法测定苹果果实总黄酮含量， 线性范围宽， 精密度和 准确度高。 本研究结果为苹果果实总黄酮含量分光光度法测定奠 定了基础。