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1、根霉菌的筛选我国是一个农业大国，农作物的秸秆是一个十分巨大的潜在可用资源，近年来，利用微生物所产生的纤维素酶将秸秆转化为营养价值较高的蛋白质饲料备受 人们的青睐。而至今未能大量把纤维素类物质作为饲料生产原料，其主要原因之一是生产上缺乏高纤维索酶活的菌。选取优良的产纤维素酶菌种是提高纤维素酶 活力的关键。不同微生物合成的纤维索酶在组成上有显著的差异，对纤维素的酶解能力也不大相同。由于放线菌的纤维素酶产量极低， 研究很少。细菌的产量也 不高，主要是葡聚糖内切酶，且大多数对结晶纤维素没有活性， 所产生酶是胞内 酶或吸附在菌壁上，很少能分泌到细胞外，增加提取纯化难度，在工业上很少应 用。因此，筛选具有
2、高活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株以及相关研究是当前 研究的热点和难点。本实验就从腐烂稻草及其附近土壤中如何筛选出可降解菌种 进行探讨。1.筛选的简要流程：纤维素分解茵的分离样品自制牛肉膏蛋白胨培养液： 牛肉膏 3g ，蛋白胨 10g ，NaCl 5g，H201000 mL， pH值为一，在121C灭菌20min,将稻草粉加入水和牛肉膏蛋白胨培养液在 28C培 养箱中培养。土壤浸出液。纤维素分解茵的分离、纯化培 养基羧甲基纤维素培养基：CM Na 15g, NH4NC3 1g，酵母膏1g, MgS0 7HH00.5g， KH2P04 lg ， H20 1000 mL。 纤维素刚果红培养基： K
3、2HPO405g， CMCNa1. 88g, MgSO70 0.25g ,明胶2g,刚果红 C.2g ,琼脂 14g, 土壤浸出液 ICCmL HHC 900mL, pHfi为6-7。PDAg养液：马铃薯 200g,蔗糖 20g，水 1000mL 赫奇逊培养液：KHPQ 1g, CaCb0.1g , MgS0-7H0 0.3g , NaCl 0.1g , FeCla0.01g , NaN02.5g ,140 1000mLpH为一。纤维素琼脂培养基：（NH4） 2SQ。2g, MgS07140 1g, NaCl 1g , CaC0 2 g，琼脂20g,水500mL 121C灭菌20 min倒平板
4、后，盖 上与平板大小一致的无菌滤纸。固态发酵培养基：稻草粉（取稻草，切成2-4cm 小段，机器打碎，过60目筛）7g，麸皮3g , （NH4）2SQ,2g , H0 20g，分装入锥形瓶， 121C 灭菌 20 min。纤维素分解茵的分离与纯化将样品置于无菌三角瓶中，加入10倍体积无菌水打散均匀后,取5 mL悬液加 入盛有50 m富集培养基（纤维素琼脂培养基）的三角瓶，在28 C和150 r/ min下， 振荡培养3-5 d后移取5 m培养液至另一盛有新鲜富集培养基的三角瓶中继续培 养。取富集后的培养液做系列稀释梯度IO-1、10-2、10-3、IO-4、10-5，分别先后涂 布于筛选纤维素琼
5、脂平板和刚果红培养基平板，置于30C培养箱中培养。分别挑选出透明圈大的真菌，接种斜面保存以备用。滤纸失重率将赫奇逊培养液分装在500 mL锥形瓶中，将1张滤纸预先烘干，称重，记录 每张滤纸重量，将每张滤纸剪成1 cm见方的小块，分别放入1瓶500 mL赫奇逊培 养液中，121C灭菌20 min。将所筛选菌株接种于上述培养基中，在 30C和120r /min的条件下，振荡培养7 10d，观察滤纸条崩解情况。培养终止后测定滤纸失重。用滤纸失重前的重量减去滤纸失重后的重量， 再除以失重前的重鼍即为滤纸 的失重率。羧甲基纤维素酶活测定取样品适当倍数稀释液1 mL加入I % CMNa容液4 mL溶于pH
6、值为4.6的0. 1 mol/L HAc NaA（缓冲液）于试管中，40C反应5 min,迅速加入1 mLNaO和2 mL DNSS剂，沸水浴5 rain，冷却后加水定溶至10 mL,摇匀后在UV一2001分光光度 计520 nmF测ODS,同时以1 mL水代替酶液，其他条件相同作为空白对照。对照 标准曲线测算酶活力。在上述条件下，酶活力按国际单位规定：定义 1 min 催化 纤维索水解生成1umol葡萄糖的酶量为1个酶活力单位（IU）。3. 筛选结果本试验分离得到了大量具有较好纤维素分解能力的细菌、 放线菌和真菌类菌 株，其中ZJ8为1株具有较高纤维素分解能力的真菌菌株。 任何一个微生物菌种
7、 的筛选都涉及到培养基组成及生长条件的选择， 对于培养基而言， 选择适当则会 大大减少工作量。 在纤维素分锯菌的初筛过程中， 本试验采用了几种分离纤维素 分解菌的培养基， 分别采用不同类的纤维素做惟一碳源， 主要考虑的是不同菌种 对几种纤维素的适应性， 如果只选用一种培养基， 可能会造成一些优良菌种的丢 失。试验证明， 刚果红培养基是较好的分离筛选培养基， 产酶菌株能在平板上形 成水解圈，因为纤维素是由葡萄糖残基以 B1， 4糖苷键连接而成的线状大分子 物质，纤维素水解酶能水解此糖苷键， 使其变为纤维二糖和葡萄糖， 水解后的糖 类同刚果红染料形成红色的沉淀， 颜色浓郁， 厚重，所以此水解圈在菌
8、落生长过 程中清晰可见， 不易发生错误识别。 这为筛选高效纤维素分解菌株提供了快速而 方便的方法，减少了工作量和筛选的盲目性。4. 滤纸失重率分析 滤纸是木材加工造纸的最终产品之一， 植物木质部含有大量纤维素、 半纤维素和 木质素， 在造纸过程中除去了半纤维素和木质素， 滤纸是由纤维素构成的， 而且 是一种天然的纤维素。纤维索是由葡萄糖分子以 B1， 4糖苷键连接而成，因此本试验用滤纸作为纤维素提供碳源， 虽然需要较长的时间才能有结果， 但能准确 反映分离菌对纤维素的降解能力。 滤纸片在加入纤维素酶溶液后自滤纸边缘逐渐 破坏，最后至全部崩解。其逐渐变化过程为：第2天滤纸边缘膨胀（图3a），第4 天滤纸整齐膨胀并下弯，第6天滤纸不定形（图3一b），第8天滤纸全成糊。菌株发 酵液中的滤纸失重率随时间变化呈递增趋势，第8天时失重率达到高峰 2964。