不同核酸提取方法对荧光PCR定量结果有何影响.doc

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1、|不同核酸提取方法和仪器对荧光PCR定量结果的影响中国人民解放军第三 0二医院 王海滨 写在课前的话荧光定量PCR质量一般有三个要素，分别是试剂、仪器和人员，另外还有标的影响。对荧光定量PCR的影响因素较多,因此要得出比较准确、 稳定性的PCR吉果,需要对各个环节进 行严格控制。荧光定量PCR质量的影响因素有哪些?一、荧光定量PCR质量的三个要素荧光定量PCR质量一般有三个要素，分别是试剂、仪器和人员。试剂是由生产厂家专门提供，包括核酸提取与扩增两个部分。 核酸提取是由不同单位的工作人员进行操作， 扩增 部分是由厂家专门制备好的。 仪器包括三个方面：温控、光学和软件，不同仪器温控、光学、 软件

2、三个部分原理和性能均有一定差异。 不同单位人员的专业知识和管理方式方法不同，对检测结果也有明显的影响。另外还有标的影响。荧光定量PCR质量的影响因素有（）A. 试剂B. 仪器和人员C. 标D. 以上均有正确答案：D解析：荧光定量PCR质量的影响因素有试剂、仪器和人员和标。试剂包括核酸提取与涉及环节较多。不同仪器温控、扩增两个部分，核酸提取是由不同单位的工作人员进行操作,光学、软件三个部分原理和性能均有一定差异。不同单位人员的专业知识和管理方式方法不同，对检测结果也有明显的影响。不同核酸提取方法对荧光PCR定量结果有何影响？二、不同核酸提取方法对荧光PCR定量结果的影响目前临床常用的核酸提取方法

3、有：一是聚乙二醇法，也称煮沸法；二是层析柱法，也 称为提纯法；第三是磁珠法，也称吸附法。第四是近年出现的血清或血浆的检测标本直接加 入方法。第五是近年罗氏公司引进的COBASTaqMan全自动核酸提取与扩增系统，其提取原理是磁珠法。（一）聚乙二醇法1、操作步骤取100微升配置好的聚乙二醇工作液，需注意目前所用的聚乙二醇一般是20%的聚乙二醇，较黏稠，试剂盒保存温度为-20度，因此在温室要彻底的复溶，溶化呈液状。加样时吸100微升，因为黏稠，一定要过吸、停顿，然后把吸头外多余的聚乙二醇粘掉，再 加到相应的操作管中。吸和加均注意停顿，加入到操作管里面的含量应该尽量精确至100微升。由于液体的黏稠，

4、不同的人、不同的操作手法差异特别大。加好100微升的聚乙二醇后加入100微升待测标本，主要包括血清、血浆或其他液体，二者要彻底混匀。第二步是 13000转离心，一般用角度离心机离心 10分钟，弃掉上清液，尽可能少留残余，并保证不把沉淀物吸掉，沉淀物含有核酸成分。 第三步加入碱性裂解液 25微升，碱性裂解液往往带 有悬浮物，充分混匀。含有核酸的沉淀物往往比较黏稠，加上碱性裂解液通过振荡混匀常常不会把沉淀物振开， 而如果通过吹打混匀， 又容易把沉淀物带走一部分。此操作环节建议操作人员咨询实际生产厂家，因为试剂盒标准品不通过核酸提取，如果这一步标本的核酸丢失过多，而外标标准又无变化，对结果的影响较大

5、，是振荡混匀或者吹打混匀，要求操作人员和厂家达成共识。最后一步是100度煮沸10分钟，后13000转离心10分钟。取上清液 进行PCR检测。2、优缺点优点是操作较快速，可部分去除标本中的PCR干扰物质（胆红素、血脂、离子等）。缺点是核酸丢失严重。弃掉的上清液含有大量 HBV（ 50%左右）；碱性裂解液核酸裂解不 彻底，与混匀程度密切相关（丢失 30%左右）。操作步骤较多，每个环节均存在不同实验室 人员和仪器的差异，因此影响因素较多。（二）层析柱法1、操作步骤层析柱方法主要用于 RNA的提取，以QlaGen试剂为例做简单的分析。它分为四个步骤：第一步是取560微升已配置好的核酸裂解液，与140微

6、升待检的标本（血清、血浆或其他的液体）混匀，室温静置10分钟。第二步加500微升的无水乙醇混匀，8000转离心1分钟。第三步是层析柱过滤，将加过乙醇的标本加到层析柱，通过8000转离心1分钟，滤掉多余液体，核酸即可在层析柱上吸附，然后用洗涤液 A和B洗脱柱上的盐和蛋白质，13000转高速离心2分钟，将层析柱和层析膜上多余的物质离下去，在层析柱的中间加50微升的洗脱液，室温静置 10分钟，让它彻底溶在水中， 10000转离心3分钟，洗 脱液即可进行PCR扩增。2、注意事项第一步核酸裂解液含有异硫氰酸胍或盐酸胍，胍盐是裂解核酸的物质，它在低温时容易结晶、凝集，结晶后如果不能彻底溶化，只是取上清液和

7、带液标本提取核酸，容易出现假阴性。通常的做法是在56度的环境让核酸裂解液彻底溶化，以肉眼看不到结晶为标准。另外是在室温静置10分钟，有的试剂盒是在72度放置10分钟。目前的核酸裂解液对病毒 的裂解效果非常强，二者混匀之后，标本中的核酸基本上在 1到2分钟均能够彻底裂解，放置的时间延长对病毒裂解效果不再有意义，反而对标本中的RNA起到降解作用。因此建议不同的实验室应摸索最佳条件。第三步是过层析柱，滤过后的液体，再进行一次过滤，发现层析柱过滤的东西含有近一半核酸，包括洗涤液A、洗涤液B洗涤下来的液体。第四步加50微升洗脱液尤为关键， 洗脱液一定要加在层析柱的中间，让它把层析膜完全浸泡，如果加在层析

8、柱的壁上，而洗脱液没有和承袭膜上的核酸进行接触，洗脱液不可能完全洗脱。每一个洗脱液均含有一定量的核酸，并且每次的丢失量几乎在一半左右。3、优缺点此方法的优点是可有效的去除标本中的PCR干扰物质，如胆红素、血脂、离子、蛋白、RNA酶等，提取的RNA的稳定性比较好。缺点是核酸丢失比较严重， 过滤丢失有50%左右， 洗脱又接近50%。另外环境因素影响较大，如 裂解液必须彻底的复溶，不能存在结晶、凝 集，离心、操作、不同的实验室人员和仪器等的差异。（三）磁珠法1、操作步骤磁珠法为新兴的方法。磁珠可以和磁吸附，因此可以省去离心过程，也有试剂仍采用离心的方法。以某公司试剂盒的 HCV磁珠法为例做介绍：第一

9、步，取100微升已经配置好、 含有磁珠的核酸裂解液，与 100微升的待检标本（血清、血浆或者其他的体液），充分混 匀，室温静置10分钟，然后8000转离心2分钟，让含有结合核酸的磁珠沉淀，去掉上 清液。第二步，加洗涤液 A和洗涤液B，分别用8000转洗涤2分钟，离心2分钟，去 掉上清液。最后一步有两种做法，一种是把PCR反应液直接加在含有磁珠的试管里，把磁珠溶开，然后直接放置于 PCR扩增管里；第二种是把磁珠加洗脱液，将磁珠上的核酸洗脱 下来，取上清液进行 PCR扩增。2、优缺点此方法的优点也是可有效去除PCR干扰物质，其缺点为：磁珠弃上清和洗涤两次去上清，实验发现每次的上清都含有相应的核酸；

10、磁珠对PCR扩增有影响，洗脱的核酸丢失。如果把磁珠上的核酸洗脱下来，会产生洗脱不彻底的情况，洗脱应尽可能在 37度到50度的环境进行，洗脱下来的核酸量较少。目前罗氏公司新出的 MQ磁珠法提取核酸，洗脱时的 环境温度为50度。（四）血清直接法1、操作步骤血清直接法是近年新出现的方法，目前市面上已有两种方法。一种可称为A法：取5微升的核酸裂解液和 5微升的待检标本（待检标本主要是血清、血浆或血细胞和其他体液， 尿液或粪便不能用这种方法），二者混匀后直接加入 PCR反应液。第二种方法可称为 B法： 取3卩I核酸裂解液，与 3卩I待检标本（血清、血浆），混匀， 95 C处理10分钟， 直接加入PCR反

11、应液，13000RPM离心1分钟直接进行 PCR扩增。高温处理10分钟可 以把标本中的蛋白沉淀、凝固，沉淀核酸吸出。和 . 法不同的是它把蛋白做了沉淀凝固， 相应的减少了 PCR干扰物质。2、优缺点此方法最重要的优点是没有核酸的丢失，定量标准。B法经过高温处理后使蛋白发生了变形，在很大程度上消除了标本中的干扰物质。缺点是无法消除标本中 PCR干扰物质带来的干扰。A法目前在国已获得 SDA批文，通过临床检测也发现对临床常规的大部分标本 影响不是很大，但是对病毒核酸比较低的标本影响还是相对较大 。（五）COBAS TaqMan全自动核酸提取与扩增系统最后一个方法是 COBASTaqMan全自动核酸

12、提取与扩增系统， 为新进入国的方法，为 全 自动化设计的病毒载量平台，具有sample-in, result-out的特点；部标准品方法定量，保障结果的准确度和精密度；实验进行中即可添加耗材、样本及试剂，软件可显示所有容的 进行状态；所有样本，试剂及耗材采用条码自动扫描设计，方便实验记录及追踪；整个试验流程应最大程度避免污染问题。分两部分，第一部分是核酸提取系统，第二部分是扩增系统。其特点为核酸提取是全封闭的，一般需要2到3个小时，可以处理24或48个标本，处理完以后直接把加好的PCR扩增管移到扩增仪器里，扩增仪器有两个扩增装置，可以单独运行。目前主要用于乙肝、 丙肝、艾滋病毒的检测。对乙肝的

13、检测围，敏感性可以达到12个 IU每毫升，线性围是 54到1.1 X 1 8。目前临床标本病人的血清病毒的含量均超过了 108 ,因此不建议用此方法检测病毒含量超过1.1 X 10 8的标本。对丙肝低限可以达到 15个IU ，线性围是43到6.9 X 10 7。临床研究发现，目前丙肝病人血清或血浆中 HCV RNA的含量基本上都涵盖在此围之，因此丙肝病人不需要做稀 释和特殊选择， HIV也是。综上所述，把握核酸提取的细节，对检测的质量非常重要，因此操作人员的专业素质尤其重要。三、仪器对荧光 PCR检测结果的影响与荧光定量有关的环境因素，对于仪器包括三个部分，第一个热模块。热模块的原理不同，会导

14、致温度均一性。目前PCR仪器的热模块主要包括半导体、空气和压缩机，空气加热相对比较稳定和快速，均一性相对较好。第二个是光学模块，即荧光的采集、照相部分。 目前大部分仪器是采用 CCD照相的原理、PMT逐行扫描和光栅的逐孔，其中PMT逐行扫描的均一性较好，CCD照相的差异相对较明显。第三个是软件模块，一般的影响因素较小，但是有的软件可以有效捕捉到 PCR扩增指数扩增的点和有效的放大倍数，此倍增的处理能 够有效的反应扩增量的变化。因此软件模块对结果分析的简易程度也有一定影响。不同的仪器的差异或同一个仪器均一性的实验常选择5点平均分布的方法。如96孔板，开在96孔板的4个角和中间，加上通往复孔的3到

15、4份标本（同一个核酸含量）， 然后进行PCR扩增，看五个区域的结果是否能够在有效的的质控围之，即为5点平均分布。通过实验可发现不同的仪器甚至同类型的仪器存在差异。因此在选择仪器时要考虑究竟是应用于科研还是临床常规检测，用于科研影响不是很大，但临床检验需对仪器间的差异做校准。图1理想化的扩增曲线图1为理想化的扩增曲线。不论标本中的核酸含量高低，都应该在按照相应指数扩增 速度向上扩增，温控、光学、软件模块都应该达到同样的标准和理论值，和实体一致。理论值和实体值要一致，才能达到比较标准的结果。图2扩增图图3标准曲线图4中高拷贝的和低拷贝的平行，它的扩增效果和倍增均一致。图5有线的交叉,即存在孔间和扩

16、增效率的不一致，对定性实验影响不大，但对定量实验会产生一定影响。图4平行曲线图5交叉曲线四、标与标定量对荧光定量的影响()实时荧光定量 PCR无需标时荧光PCR不需要标。实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。1、Ct值的重现性：PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值 的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管扩增，得到的Ct值是恒定的。2、Ct值与起始模板的线性关系：由于Ct值与起

17、始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准与标本同步进行核酸提取的曲线定量方法。（二）标对实时荧光定量 PCR的影响若在待测样品中加入已知起始拷贝数的标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。 但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为标。正因如此，定量方法虽然加入标，仍为一种半定量方法。美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和标法定量的方法学比较，得出的结论是：标法作为定量或半定量的手段是不可靠的

18、，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方法。图6可看到标在高拷贝时比较低。如果标本含量比较低，标是5 3，标本里含量是102，标会把标本曲线压的比较低，出现偏差，甚至出现假阴性。（三）标的失败率对采用3家公司考核试剂标失败率分析结果显示，3家试剂的标均存在标失败的情况，但各不相同，阳性标本的失败率在3.2%-16.5% ，阴性样本的标失败率在 4%-7.2% ,高于COBAS的失败率（1.7% , 1/60 ）。掺入标的量大多为 5 X 10 3左右，采用PEG和 直接加入两种方法对 2 X 103的HBV阳性血清进行96孔重复核酸提取，失败率均为0。（四）标定量的误差（以 CO

19、BAS TaqMan为例）图6标定量的影响 5.8 ,比阴性对照和低拷贝的更为靠前。另外对于高拷贝标本中的DNA，其标反而出现相反方向偏斜。因此用COBASTaqMan标定量的方法进行定量，不建议做高拷贝的标本，尽可能是低于106的标本。标定量存在另一个问题是如果标本中的含量非常低，标本身会对标本中的核酸扩增产 生抑制作用，从而降低敏感性。五、总结试剂核酸提取、仪器和人员及标结合起来对荧光定量PCR的影响非常大，它的组成部分比较多，因此要得出比较准确、稳定性的PCR结果，要对各个环节进行控制。如试剂环节，除了厂家生产要标准化之外，核酸提取尽可能减少核酸的丢失，扩增试剂尽可能效率要高。准入的仪器

20、应该能满足临床的需求。但如果要收到稳定和敏感性较高的检测结果，对仪器的选择要进行校准和比对。人员自身的专业知识和实验室的管理都非常重要，要对人员进行培训，人员操作要熟练，专业知识一定要结合实地、仪器的特点，找到其关键的环节，影 响因素比较大的部分一定。PCR实验室工作因为比较精细，管理方面尽可能减少人员的流动等，严防实验室的污染。标包括标从核酸提取的标，不参加定量，只是控制假阴性、假阳性。另一个是标定量。两种标都参与PCR竞争。个人的观点是尽可能不要通过标对 PCR进行质量监控，要通过科 学合理的人员培训、有效的实验室的设置、提高试剂检测质量和减少污染， 才能得到有效的 检测结果。试剂核酸提取、仪器、人员、管理及标各个环节进行严格的质量控制。