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1、实验(三)厚薄血膜涂片法检测病原体实验目的：1、掌握班氏和马来丝虫微丝蝴、布氏姜片吸虫成虫及虫卵的形态结构。2、掌握厚薄血膜涂片法操作过程及应用3、加深丝虫和布氏姜片吸虫的有关理论内容。4、了解布氏姜片吸虫成虫的形态。实验内容：1、复习丝虫、布氏姜片吸虫的有关理论内容。2、观察班氏微丝蝴、马来微丝蝴的玻片标本；观察布氏姜片吸虫虫卵。3、小白鼠尾取血厚薄血膜涂片法操作，瑞氏染色镜检。4、观察布氏姜片吸虫的成虫大体标本。5、作业：画出班氏微丝蝴、马来微丝蝴、布氏姜片吸虫虫卵的形态。微丝蝴班氏微丝蝴马来微丝蝴大小科244296X 5. 37177230X 56体态柔和，甯曲自然，无小弯甯曲僵硬，大弯
2、上有小弯头间隙(长:宽)较短，1 ： 1或1 ： 2较长，2 ： 1体核较小，分布均匀，清晰可数较大，排列紧密，相互重叠，不宜分清尾核无有2个尾核，前后排列，尾核出角皮膨 大布氏姜片吸虫成虫 (染色标本)(1)虫体呈长椭圆形，前端略尖，后端钝圆，背面稍隆起，腹面扁平，较肥厚。长2075mm ,宽 820mm,厚 0.53mm。(2) 口吸盘位于虫体亚顶端；腹吸盘靠近口吸盘，呈漏斗状，较大，肌肉发达，比口 吸盘大45倍，肉眼可见。(3)消化道有口、咽、食道和肠支。肠支在腹吸盘前分为两支，呈波浪状向后延伸至 虫体末端，形成盲管。(4)雌雄同体。两个睾丸前后排列，高度分支呈珊瑚状，占据虫体的后半部。
3、卵巢分支，位于睾丸与子宫之间，以输卵管与卵模相通。卵模位于睾丸前的体中横线上， 外有梅氏腺包绕，有劳氏管，无受精囊。卵黄腺发达，分布于虫体两侧，从腹吸盘以下直至 虫体末端。生殖孔位于腹吸盘前缘。布氏姜片吸虫卵为寄生于人体最大的虫卵。大小为130140X8085 m,淡黄色，椭圆形，卵壳薄而均匀，一端有一不明显的卵盖，卵内含一个卵细胞和2040个卵黄细胞。厚薄血膜涂片法：常用于丝虫病，疟原虫的检测。操作方法：（1）采血： 采血时间 在普查时，一般无法考虑采血时间。在临床上，对现症病人一般可随时采血， 但为了提高检出率， 就应当考虑采血的适当时间。 对典型发作的间日疟及三日疟患者，应选择发作后数小
4、时至10 余小时采血为好。此时疟原虫发育至环状体乃至大滋养体，虫体大，疟色素已形成，受染红细胞也出现变化，有利于疟原虫的检出。恶性疟原虫大滋养体和裂殖体是在皮下、 脂肪和内脏微血管中发育的， 通常在外周血液中不易查到， 配子体在环状体出现1 周后方能见于外周血液，故在发作时采血。 采血部位从患者耳垂或指尖 （以左手无名指为宜） 取血， 婴儿通常从大姆趾第二趾骨腹面针刺采血。 采血方法用75% 乙醇棉球消毒取血部位皮肤，待干后用左手拇指和食指捏住采血部位， 右手持针迅速刺入皮肤，待血液流出或轻轻挤出血滴，供制作涂片用，采血完毕用干棉球轻压伤口止血。（2）制片 ： 薄血膜的制作取 1 滴血于 1
5、张洁净的载玻片上，选 1 张边缘平整、光滑的载玻片作推片， 用左手拇指和中指夹持其两端， 将推片的边缘中点与血滴接触， 并与载玻片呈 30o45o 夹 角，待血滴沿推片边缘向两侧展开后，立即由右向左迅速推成薄血膜。理想的薄血膜要求红细胞均匀地铺成一层， 无裂痕， 其末端凸出呈舌尖形。 注意： 推片时用力 和速度要均匀，不能中途停顿或重复推片， 以免造成血膜断裂或厚薄不匀。如取血量多， 夹角宜小；取血量小，则夹角可大些。 厚血膜的制作 用推片的一角接触刺血点上的血滴，取血 2 滴，置载玻片上，并从里向外作旋转涂布，使成直径为 0.8cm 大小的圆形血膜，厚薄要均匀，然后平置桌上，待自然干燥。 厚
6、薄血膜同片制作用目测法将载玻片从右到左等分成 6 格，厚血膜涂在第3 格中央，薄血膜涂在第 4 格前缘至第6 格中部，第1 、 2 格可用于贴标签，制作厚、薄血膜方法同上。（3）染色：瑞氏染色法（Wright staining厚血膜需先溶血，溶血方法为：滴加数滴蒸馏水于厚血膜上， 使红细胞溶解， 待血膜呈灰白色时， 将水倒去， 晾干。 取制作好的血片，在血膜两端用玻璃蜡笔各划一竖线， 滴加瑞氏染液数滴， 使其布满血膜，染液中含甲醇，约0.51 分钟将血膜固定，然后加等量缓冲液或蒸馏水，轻摇载玻片，使之与染液混匀，很快液面出现灿铜色膜，约经 35 分钟染色后，用缓冲液、蒸馏水或自来水冲洗。 注意
7、：切勿倾去染液再用水冲洗，以免血膜上沉着染料颗粒，影响镜检 。如厚、薄血膜涂在同一张载玻片上， 先在厚、 薄血膜中间及两侧用蜡笔各划一条竖线， 滴蒸馏水于厚血膜上， 使之溶血，待血膜干后，与薄血膜一起染色。吉氏染色法（Giemsa stainin。取吉氏染液原液，用pH7.07.2 的磷酸缓冲液稀释 1020 倍。厚血膜不需固定，薄血膜先用甲醇固定（如厚血膜在同一张载玻片上， 切勿延及厚血膜） ，干后滴加稀释的吉氏染液， 布满血膜 （如大批染片，可置入染色缸） ，染 2030 分钟，冲洗，晾干后镜检。稀释的染液，宜用时现配，否则易产生沉淀，影响染色效果，大批染片时，应根据染色时的条件，如不同病
8、人的血片，染色时的室温、染液稀释程度、冲洗水的 pH 值等情况的不同，先试染少量血片，摸索出染色效果最佳的时间和条件，再大批染片。 此外，染色时间应随染液稀释情况作适当的调整， 染液浓度高，染色时间可短些，反之则长。吉氏染液配制：吉氏染剂粉 1g,甘油50ml,甲醇50ml。将染剂粉置研钵中，加少量甘油， 充分研磨， 再边加甘油边研磨， 直至甘油用完。 然后加少量甲醇， 研磨后倒入棕色瓶中，剩余的甲醇分几次冲洗研钵中的染液，全部倒入瓶内，塞紧瓶塞充分摇匀，置65温箱内24 小时或室温下1 周后过滤，即成原液。瑞氏染色法操作简便、快速，临床上经常使用，因甲醇易于蒸发， 如掌握不当可能在血膜上产生
9、沉淀，妨碍观察。同时染色结果也不大一致，在较热的环境中较易褪色，保存时间较短。 吉氏染色法染色效果良好， 对厚血膜尤佳。 经稀释后的染液对厚血膜兼有溶血和染色的双重作用。染色后，疟原虫细胞核和细胞质红蓝分明，很 少出现沉淀，不易褪色。适用染大批血片标本，供教学使用，但染色需时较长。(4)镜检 在检查薄血膜过程中，有时遇见与疟原虫形态类似的物体，应注意区别排除。如单个血小板附于红细胞上， 易误认为环状体或成长中的滋养体。 成堆的血小板误以为成熟的裂殖体。血小板的形状多样，或呈圆形，卵圆形，有时呈不规则多角形，其长径约为红细胞的 1/31/4 。 血小板中央部常呈紫红色颗粒状结构，周边部分着色浅，
10、但不如疟原虫紫红色胞核与浅蓝色胞质分得清楚。 此外， 还有染色液沉淀颗粒以及偶有细菌、 霉菌、 尘粒、 白细胞碎片重叠于红细胞上， 很像环状体和成长中的滋养体。 但这些物质大多呈一种颜色， 如细调显微镜焦距， 可以看出它们与红细胞不在同一水平面上。 厚血膜中 疟原虫比较集中 (一个视野可见到的细胞数约相当于20 个 薄血膜视野) ，但厚血膜经溶血后，红细胞轮廓已消失，原虫皱缩变形，虫体比薄血膜中的略小，有的原虫胞质着色很深，胞核模糊不清，初学者较难识别。检验人 员必须经过一段时间的严格训练，在充分掌握薄血膜中各种疟原虫的形态特征后，才能认清厚血膜中的疟原虫。当厚、 薄血膜涂在同一片时，应先检查厚血膜上的疟 原虫，如鉴定虫种有困难，可再仔细观察薄血膜，以提高镜检效果。