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1、单味中药协同诱导小鼠CIK的初步讨论细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killercell , CIK）作为一 种高效的肿瘤杀伤细胞，在肿瘤过继免疫治疗中显示出良好效果，在人类 CD+3CD56的T细胞是CIK群体中主要效应细胞。小鼠 CIK细胞，表面高表达 NK1. 1和CD8分子。国内也有不少关于中药协同 DC或CIK杀伤肿瘤的报道， 但目前人们对其研究大多集中在临床应用。笔者对于将小鼠脾淋巴细胞诱导为 CIK进行了研究，成功用纯细胞因子诱导出了小鼠CIK细胞，且明确了诱导方法。在此基础上，本研究以加入几种中药水煎剂同时细胞因子用量减少为原来的 1 /2，探讨中药协
2、同诱导小鼠CIK的可行性。1材料与方法1. 1 实验材料实验动物为C57BL/6小鼠，68周，雄性，购自北京维通利华实验动 物技术有限公司（合格证号：中药材虫草、石斛、黄精、仙 茅、黄芪、人参、灵芝及半支莲购自北京同仁堂制药有限公司；重组小鼠IL - 1、 IL - 2、- IFN 购自Peprotech 公司；小鼠CD3单抗（145 - 2C11）、荧光标 记单抗 NK1. 1 - PE、CD3e - APC CD8 - FITC 和 DX5 - FITC 购 eBioscienee 公司；小鼠淋巴细胞分离液（达优）购自达科为生物技术有限公司；1640培养 基、胎牛血清、青链霉素购自 GIB
3、CO公司；CCK- 8杀伤试剂盒购自东仁化学科 技（上海）有限公司。1.2 小鼠外周淋巴细胞制备C57BL /6小鼠行眼球摘除放血后拉颈处死， 无菌条件下取脾脏，分离脾细胞，加入到小鼠淋巴细胞分离液中，密度梯度离心 法获取小鼠淋巴细胞，无血清1640培养基洗涤两次，用1640调整细胞浓度为 1 106 /ml。1.3 中药药液制备将1. 1所列中药材剪碎放入煎药锅中，加入适量超 纯水，中火力煎制，务使其保持微沸状态煎20 min,弃药渣，调节药液体积达1 g生药对应10 ml药液。分装后冻存于-20 C冰箱。1. 4确定最适用药浓度如1. 2所述制备小鼠淋巴细胞，并铺入 96孔细 胞培养板，放
4、在37 C、5%C0孵箱中过夜孵育后，按浓度梯度（浓度范围200 0. 032 g /ml）在各孔中加入中药水剂，后经 CCK - 8检测，获得每种药剂最适使用浓度。1.5 小鼠淋巴细胞的诱导1.5. 1纯细胞因子诱导1.2方法制备的小鼠淋巴细胞置培养瓶中，培养基为含10%胎牛血清和1 500U/ml - IFN 的1 640，于37 C、5% CO培养， 24h后再向每孔培养基中均加入抗 CD3单抗(50 ng /ml) 、IL - 1 ( 200 U/ml)、 IL - 2 ( 300 U/m1) 。以后每3天更换含相同浓度血清和IL - 2 的培养基。1.5. 2单味中药协同诱导将1.5
5、. 1 方法中所用细胞因子的量减少至原来量的1 /2，同时加入相应最适浓度的中药水煎剂，其他培养条件及方法与1.5. 1 相同，诱导效果由流式检测作为评价方法。1. 6诱导细胞的流式检测取培养2周的细胞进行流式细胞检测。将细胞用0. 2% BSA的PBS (流式检测Buffer) 洗涤两遍，再用该Buffer重悬，调 整细胞浓度为1 106 /ml 0将4种荧光标记抗体双染组合(NK1. 1 - PE + CD3e -APC、NK1. 1 - PE + CD8 -FITC、CD3e - APC + CD8 - FITC、NK1. 1 - PE +DX5 -FITC)分别稀释于50 l冰冷的流式
6、Buffer中，再分别向各管抗体中加入 50 l细胞悬液，混匀，置4 C避光反应30 min;用冷Buffer洗涤两遍，每次1ml。 最后用100 l冷Buffer重悬细胞，上流式细胞分析仪检测。阴性对照用未诱导 的小鼠脾细胞。1. 7诱导细胞杀瘤活性检测依据流式检测结果，将CIK细胞特征性表面分子表达高的协同组分 别与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合培养，效靶比分别为：50 : 1、25： 1、10 : 1o 用CCK - 8试剂检测其对上述肿瘤细胞的杀瘤活性。杀伤活性计算公式为：杀 伤率% = 1 -(实验A值-空白孔A值)/( 对照孔A值-空白孔A值)%。2结果2. 1 通过梯度稀释的中药水
7、煎剂作用于小鼠淋巴细胞，后用CCK - 8检测，得出各药促进细胞生长的最适浓度，用于接下来实验的使用浓度依据。2. 2不同中药水煎剂协同诱导的细胞经流式检测，与纯细胞因子诱导的相比，其中虫草、石斛、仙茅、黄芪 4种药剂可以在所诱导细胞表面表达与之 相近量或更多的 CIK特征性分子(NK1. 1 + CD+8 CD+3CD8+NK1. 1 - DX& )。2. 3虫草、石斛、仙茅、黄芪协同诱导的细胞和小鼠SP2/0细胞按不同效靶比混合培养后，用CCK 8试剂检测杀伤活性，结果显示石斛、仙茅和虫草 组在效靶比较高时杀伤活性亦高，效靶比较低时杀伤活性差，黄芪组在中等效靶 比时显示出杀伤效果，而高和低
8、效靶比时无杀伤作用综上结果可以得出：虫草、石斛、仙茅、黄芪4种中药水煎剂协同细胞组合诱小鼠脾细胞，所得到的细胞表面NK1. 1、CD3 CD8高表达，与纯细胞因子诱导得到的细胞相比，CD3 CD8双阳性率更高，且该4种细胞对肿瘤细胞的杀伤作用明显，符合CIK细胞的特征。 因此，这4种中药水煎剂可以协同细胞因子成功将小鼠脾淋巴细胞诱导为CIK细胞3讨论很多中药在临床上有调节免疫的功能，实验也证明它们可直接作用于各类 免疫细胞，如促进其活化和增殖、增强其功能等。因此二者结合，探讨中药是否 可以在体外诱导和增强CIK的作用是很有意义的。作为初步研究，本研究所选 中药是在临床和实验中早已证明具有调节免
9、疫及在抗肿瘤中常用到的单味药，并且使用的是中药的水煎剂。在这个基础上，可进一步探讨方剂及药物单一成分对 CIK诱导和功能发挥的作用。本研究所选中药中，有4种中药（虫草、石斛、仙茅、黄芪）的水煎剂 可以在减少细胞因子用量的情况下，有效诱导小鼠淋巴细胞表达CIK特征性表面分子。对其所诱导的CIK进行杀伤小鼠肿瘤细胞实验，结果表明与纯细胞因 子诱导的CIK相比，石斛、仙茅和虫草组在效靶比较高时杀伤活性高，其中石 斛和虫草组效果相对更好，仙茅效果较差。效靶比较低时中药各组杀伤活性差， 黄芪组在中等效靶比时显示出杀伤效果， 而高和低效靶比时无杀伤作用。这其中 原因可能是：CIK本质上是一群异质性细胞，不同中药参与诱导的细胞群成分有 所差异。另外，本研究所诱导的 CIK （包括纯因子诱导的）与前期工作中用纯 因子诱导的CIK在表面分子表达百分比上也有所不同（本次CD+3CD+占优）， 可能原因为本研究诱导中-IFN和IL - 1用量高于前期研究。综上所述，本研究初步明确了利用中药在体外协同或促进 CIK的诱导是 可行的研究方向。进一步深入研究建立用于筛选可诱导 CIK效应细胞或可增强 CIK杀伤肿瘤效果的中药及有效成分的体外模型系统， 对阐明其作用机制有着积 极意义和前景。