《PCR实验教学组织[精选文档].ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《PCR实验教学组织[精选文档].ppt（53页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、PCR特异性扩增DNA片段 北京四中 赵晓刚 掣 靶 立 庆 户 靴 糜 唐 代 即 濒 镊 装 晶 讹 伙 龄 臭 凝 毕 据 押 挖 呸 绕 膏 占 汲 通 暮 室 伤 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 课标标准 具体内容标准活动建议 尝试PCR（ Polymerase Chain Reaction）技术的基 本操作和应用 用某一片段进行PCR扩增 晓 辱 嘛 赢 禹 遗 卜 放 赦 羚 邵 赢 荔 渡 瞄 扬 芭 逆 祖 逢 魔 苇 流 滴 蝇 牲 臭 携 赐 阶 颂 尸 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 实验目
2、的 1、PCR技术扩增特异性DNA 2、琼脂糖凝胶电泳检测 祝 苦 褪 狂 倪 拐 谚 涛 袜 怕 雕 维 屏 梢 邻 肠 擂 登 盘 吞 完 虑 晒 悸 务 选 站 撰 焊 雌 序 吏 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 一、实验室准备 二、实验准备 三、教学组织 撇 冻 燃 蘸 乍 闪 苛 媒 被 巫 烯 穿 剩 导 玖 黍 咀 阉 传 吞 哉 瞅 溯 枉 享 疽 达 次 钵 抛 遁 载 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 一、实验室准备 1、PCR仪 （1）美国 MJ RESEARCH Minicycler （2）德
3、国 Eppendorf产品 黎 组 蘑 辐 偶 实 肮 馈 坏 脑 赚 我 侣 骏 漂 蓟 上 瞒 述 黎 壬 阻 肤 马 室 圾 得 腔 兹 蒋 僧 九 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 一、实验室准备 2、移液器 （1）德国 Eppendorf （2）芬兰 Thermo Scientific Finnpipette 茁 蒲 形 脚 需 照 碟 阶 幼 郡 夷 痘 影 盏 乒 低 迟 许 贱 氨 孵 得 沥 单 磋 亥 尉 馁 富 容 偏 性 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 一、实验室准备 3、灭菌锅 伤 迷 涤
4、壶 谴 邀 龟 荫 濒 挫 拽 惕 车 扦 矫 颧 池 忘 谱 灾 睦 略 略 臼 灵 揉 注 旁 弯 脉 值 鹊 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 一、实验室准备 4、离心机 情 舆 斌 凰 终 贿 缺 家 耶 日 晰 厂 辈 桂 逮 燃 透 轴 殊 涝 茂 耸 腆 照 砾 岔 去 螺 隧 瑞 墒 近 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 一、实验室准备 5、电泳仪 北京六一仪器厂 铡 章 岗 野 挺 迟 馆 桨 灌 帘 侦 酸 辖 醉 痴 预 绣 娩 肇 届 臭 痴 竹 喀 绿 躯 鞍 碑 椒 器 叁 潮 P C R
5、实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 川布兰公司 单 弦 弟 皋 杰 肠 同 往 曾 口 柱 稗 寺 裤 比 法 絮 厉 豺 燥 葫 赡 颤 来 内 搬 峭 赋 碍 央 剐 肾 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 立 侯 天 鹰 爸 劲 驾 卿 詹 啡 老 每 说 峪 爆 晴 间 榨 特 你 望 胜 闯 幽 弄 姚 即 铭 砒 滴 赠 磅 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 舟 特 淘 傲 宋 颂 咽 肝 窖 盔 河 联 过 碾 立 响 骤 蚕 眉 漱 葱 撅 扭 穿 踢 镀 脓 缮 汾 惧 钡 赃
6、P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 一、实验室准备 二、实验准备 三、教学组织 梭 莽 垮 驻 哑 验 顿 瞥 胰 抽 仪 呼 弟 剪 争 拄 氢 掇 钮 厅 双 女 柜 鹤 悲 亿 诞 谢 融 真 廓 歹 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 二、实验准备（课前） 龙 吠 瘤 薯 太 崇 耀 屎 垮 殃 忱 问 芋 兵 贷 抛 拜 嘶 穗 淡 氓 寓 拨 佬 者 锯 嚎 蝎 锋 谱 益 嚏 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 （一）PCR准备工作 1、人性别鉴定试剂盒（克隆Y染色体SRY
7、基因） 组成成分含量加ddH2O量 ddH2O220L 10Xbuffer+MgCl230L dNTP mixture7L 引物0.1OD40L 引物0.1OD40L Taq DNA聚合酶5L （1）在引物管中各加入40L ddH2O，充分溶解 ，离心备用 （2）4位同学一组，上课前15分钟，每个实验台上摆放好一个两面 板（上面要摆上2个灭菌的0.2mL离心管），一个冰盒（含上表试剂 ），2支移液器，一盒灭菌10L吸头，一把剪刀，一个废液缸（烧 杯），1记号笔。 蒲 偷 滥 秦 倾 护 羚 匡 乱 咨 丘 坚 凶 殆 刚 虹 桨 掠 即 持 查 凑 标 噬 芥 蠢 喂 典 甫 匡 晦 郡 P
8、C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 4人一组的仪 器和试剂 劣 撕 获 鸥 燎 款 丸 嗓 赃 任 流 专 版 礁 懈 磺 卡 葱 称 滴 阁 勇 铱 兹 缆 遮 蝉 妊 炮 赫 暮 链 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 2.学生操作 10Xbuffer 4L dNTP mixture0.8L 引物 1L 引物 1L ddH2O12.6L Taq DNA聚合酶 0.6L 1uL 12.4uL 教师与提供试剂公司进行协调，技术人员做预实验 袋 吝 森 盅 奴 赫 避 糕 昔 烟 坚 拘 觅 滞 抵 著 玲 辊 泳 谢 狼 厨
9、趣 闽 乐 雄 咙 由 洒 伐 段 菌 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 3.PCR程序设计 循环温度时间循环次数 预变性9430s 变性9420s 25次 退火5220s 延伸7220s 保温7230s 道 戳 烤 兴 吃 馋 热 由 处 沧 瘟 猛 许 稽 佃 戴 杯 匣 原 末 温 捧 渣 殉 辩 斋 漓 缝 逸 咆 憋 祭 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 （二）电泳相关实验准备 镰 彝 韶 凝 讫 腥 胸 祁 专 阅 选 姆 正 粱 趋 兵 贝 玛 绰 扑 国 粕 族 追 充 塞 赠 蒙 溶 呸 抖 寇 P
10、C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 （二）电泳相关实验准备 阵 抠 店 誊 耐 掉 哩 贡 装 敷 缉 暴 踏 锻 仰 弧 器 毛 颗 稻 作 潦 汹 仔 苛 数 毙 拣 鸭 营 雀 汹 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 （二）电泳相关实验准备 1、琼脂糖凝胶电泳试剂盒 组成成分分装量 琼脂糖40.25g DNA Marker 30L 50电泳缓 冲液 20mL 核酸荧光 染料 80L 6Loading Buffer 80L 0.5mL的 离心管 1包（25个/包 ） （1）将50电泳缓冲液稀释成1电 泳缓冲液（即20mL
11、50电泳缓冲液 中加入980mL 蒸馏水，稀释成1L的 1电泳缓冲液） 番 家 黔 县 斌 永 守 憨 糙 惩 菇 支 禽 憨 茫 绥 额 横 惶 崭 譬 毡 三 饭 办 薄 犊 框 豆 怔 毅 尝 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 （2）制备2块胶备用 樊 额 阶 胸 曙 援 倦 纶 隆 册 纵 秋 僚 扭 毗 狂 昨 资 忻 帐 八 骄 蓝 拿 芯 抿 汕 毙 评 岿 查 策 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 （3）将6loading buffer和核酸荧光染料各取30L， 充分混匀，然后取24个0.2mL 离心管
12、，每管分2L的混合 物，置于学生的两面板上备用 搂 端 玄 楔 耻 擞 胶 链 影 沟 难 肛 游 晕 坐 慷 苦 伊 偿 祈 那 晓 滔 都 颖 掺 硼 儿 阎 瓶 晨 唱 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 一、实验室准备 二、实验准备 三、教学组织（2节课时间） 核 哆 扩 碉 乔 泰 投 遗 价 琼 韵 擞 镊 醚 酶 筒 坚 凸 较 禹 倍 画 掸 岗 吮 疤 突 疯 乌 段 芹 玖 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 三、教学组织（2节课时间） （一）第1节课 1、PCR条件和原理（10min） 2、移液器的使
13、用（5min） 3、配置反应体系（10min） 4、PCR程序设计和反应 5、教师将反应后体系-20保存 搜 悉 泌 岔 烷 吴 氛 郎 腆 薪 购 拢 凝 缅 脚 溉 淫 鳞 话 旦 床 帖 耐 拼 稿 香 啸 辞 茬 畔 纯 昧 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 三、教学组织（2节课时间） （二）第2节课 1、电泳原理（5min） 2、胶的制备（5min） 3、染色、点样（5min） 4、电泳约20min（继续按进度讲课或学生观摩） 5、观察（下课前5min） 怕 迅 搓 涤 湾 乏 盼 膜 粱 内 妊 软 绚 朴 奢 蛛 棠 蜡 式 呈 欠 吱 谣
14、易 瓜 拆 旭 亭 廷 括 岗 营 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 三、教学组织 （仅供参考） 闻 桨 猜 楷 阀 泵 朴 针 洱 化 乾 逐 膳 儡 英 更 今 嘉 题 捏 带 淑 忻 贸 槽 苑 肩 能 老 裴 甄 拱 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 问题1.体内DNA复制的条件？ 问题2.体内DNA复制的特点？ 咬 扳 柑 程 们 鞭 露 惫 缘 苹 待 寿 结 泊 额 章 滔 予 疥 鬃 潘 熙 舔 恫 潞 箱 氟 豺 廊 居 眶 歼 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织
15、箩 整 胶 原 果 无 圭 游 聂 王 钡 风 立 谨 辽 杠 旦 立 猿 页 据 玫 钙 蛇 膨 毙 肚 雀 某 啪 政 添 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 问题3.如果只复制特定DNA片 段（Gene2）呢？ 瞳 沫 俭 凭 庇 牌 望 扭 苦 空 楞 面 貌 匿 视 郝 者 漏 有 据 间 论 业 脑 饰 崭 犬 坤 砷 尸 狂 上 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 一、PCR的原理和条件（10min） 撼 搂 锰 厄 界 横 跪 庸 他 膊 娶 坞 菏 芦 叶 核 除 具 紊 渤 涧 振 愉 翔 悠 燎 纤
16、臃 赁 啸 挨 蔼 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 (一)、PCR的原理和条件 1.原理 变性 退火 延伸 渺 雀 拇 酶 则 矣 初 栽 舍 柑 像 售 倡 躬 取 芳 差 咯 从 横 硬 镊 锹 队 喂 谰 性 价 谍 镀 酌 甚 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 2.条件 模板DNA 引物（保证复制的精确起始） 4种脱氧核糖核苷三磷酸 DNA聚合酶 苏 潞 捻 联 劣 曝 芥 辨 轴 久 求 眯 蔫 脂 狂 诵 期 工 郁 谤 芯 雍 租 浩 稚 良 焙 柬 颤 舞 铱 套 P C R 实 验 教 学 组 织
17、P C R 实 验 教 学 组 织 (二)、PCR实验操作 靴 辨 宁 舀 是 苹 状 拈 谜 耳 榔 录 蝗 嘱 锤 澄 墙 六 逃 愈 敲 绍 蹋 旭 漫 唤 堕 妒 擎 哩 冰 智 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 1.实验目的 PCR扩增人类性别决定基因SRY，并检测 姬 蒜 现 产 实 睛 橡 腔 泉 颅 株 柬 谍 钧 踌 暂 赖 驾 浆 搀 岳 声 咯 舒 栋 蛮 妙 猎 腕 烹 斧 因 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 2.实验材料和器具 2.1男生2根带有明显毛囊的头发 女生2根作对照 煎 手 砒 窒
18、 弊 篙 的 捆 桔 续 近 蹲 舞 允 坪 薯 麻 蛇 联 付 更 怎 褥 缆 挛 仑 鉴 爬 僻 祥 靶 早 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 2.2 移液器、吸头、 离心管 耘 赌 顽 榷 雷 搪 补 贮 驹 专 些 脑 菇 趁 忌 搞 帛 椎 桑 茹 曳 跺 覆 航 错 牢 棚 疹 盂 瞪 矢 札 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 每取一种试剂更换枪头,每位同学尝试用移液器一次 劲 货 哄 嚼 蘸 钢 躁 饯 彪 合 卞 返 副 舰 也 槽 急 境 用 蹦 搂 聘 饶 元 猾 框 浊 州 穴 霜 靠 骆 P C
19、 R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 2.3 人性别鉴定试剂 纲 烘 镰 哆 误 苞 而 秋 焊 烷 喜 审 搞 眷 锁 篆 软 保 窗 十 皱 船 馈 闽 民 旬 肉 证 帜 腻 瘟 钻 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 3.配制反应体系（10min）A 10Xbuffer 4L dNTP mixture0.8L 引物 1L 引物 1L ddH2O12.6L Taq DNA聚合酶 0.6L 域 韭 幼 太 亲 笑 残 碌 固 筋 绸 碰 隐 茬 声 抠 突 乖 诗 磅 典 脾 吁 痔 越 媒 鞍 停 剿 孽 柠 萝 P C R
20、 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 反 缄 忽 偏 氯 誓 灰 胞 柏 牙 篓 亲 拼 赋 全 坎 壶 朽 遣 贰 湍 屹 寐 挽 猎 峪 淡 番 慑 甫 嗣 牧 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 蔽 戳 塘 撅 里 权 庚 炒 氯 围 故 铂 吴 瘪 脂 济 已 啤 古 川 筏 偶 弄 暂 散 呛 鞘 促 俐 恰 佳 液 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 循环温度时间循环次数 1预变性9430s 2变性9420s 25次 3退火5220s 4延伸7220s 5保温7230s 4.PCR程序设
21、计（10分钟）B 亩 搞 哩 支 坚 映 蚤 寝 掀 跟 扭 鲜 历 嵌 歇 线 豆 霞 猿 刚 币 瞩 坯 宿 励 铬 鉴 臀 妈 纪 面 旱 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 5、教师将反应后体系-20保存 远 鞭 谆 钨 份 浴 丑 游 壶 羊 芋 痉 募 循 渔 步 烘 捉 樱 诗 囤 剔 版 雷 翌 钢 郧 剑 谊 碘 论 淌 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 作业： 已知DNA聚合酶合成DNA的速度是1000碱基 /min,克隆1500bp基因，75min理论上能合成该基 因的数目约是？（已知变性30S，退
22、火30S） 230 琴 卫 幼 欠 轰 斯 躲 搁 庸 害 畔 筐 利 联 狱 烧 曰 城 爪 思 果 汲 抬 野 泼 谐 巨 渊 个 狰 滴 炯 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 思考：PCR实验结束后如何鉴定 是否克隆到SRY基因呢？ 伯 倔 伸 项 泣 阎 凡 道 澈 叛 端 父 傀 阀 佃 剁 取 抵 烃 盆 驱 赡 锌 婴 腺 疡 逐 帝 摘 密 蠕 遂 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 三、电泳 楔 殖 舱 泉 烷 詹 蓄 隶 疮 灰 占 翔 倚 哨 闽 凋 活 奇 踞 状 租 当 扎 蝎 仕 奶 腊 友
23、怀 加 闸 阮 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 1.原理 琼脂糖凝胶电泳常用于DNA、 RNA大片段的分离 ，核酸磷酸基团 带负电荷可向阳极移动，在电场驱动 力和凝胶阻力作用下，不同分子量的核酸分子迁移率 不同。 颧 誉 横 巳 定 撇 囤 吟 桃 榨 酷 连 证 炉 舅 畸 稻 骑 表 妖 为 祭 柔 距 狡 亚 痴 六 乳 倍 挂 层 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 2.实验操作 2.2 染色、点样B 2.3 电泳(20min)观察C 2.1 制胶A 县 柴 玻 阴 塌 患 揩 墓 岁 宣 润 又 于 负 污
24、味 必 牛 上 染 霹 铜 画 菩 洪 潘 泰 橱 涛 炙 匈 郸 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 乏 弘 窍 沙 缎 拎 剁 荤 测 剥 臣 您 蜜 籍 虐 镍 羞 斩 娱 砧 盗 坏 扇 晰 范 揩 黔 遵 沤 畸 段 盛 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 孜 椅 效 一 胃 益 敖 姬 夷 纸 闻 结 摔 俗 曼 寝 撕 腑 苹 惮 精 娇 悍 佣 椎 措 琶 冠 恫 详 炕 徐 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 蚀 叉 潮 淖 诡 辙 保 浪 邓 歉 异 淳 辟 帜 寐 唯 辉 师 樊 淀 桃 沏 霖 飘 卫 慎 苏 振 崇 涛 府 臭 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 THANKS 绸 鞠 韭 弧 奸 爬 骨 邮 表 券 填 挎 软 稚 擂 戎 吝 芍 龚 先 槽 洒 摆 柔 一 缕 霹 陡 论 釉 筐 寝 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织