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1、基于神经氨酸酶活性检测的板蓝根品质的生物评价李寒冰1,2,鄢丹1,王伽伯1,王京燕3,贝祝春3,魏丽1,2,肖小河1*(1.中国人民解放军第302医院全军中药研究所，北京100039;2.成都中医药大 学药学院，四川成都610075;3.军事医学科学院微生物流行病学研究所，病原微生物生物安全国家重点实验 室，北京100071摘要：采用流感病毒神经氨酸酶(NA体外活性荧光检测法测定板蓝根的NA抑制生物活性，并建立板蓝根抗病毒生物效价检测方法。研究表明板蓝根具有抑制 NA的活性，IC50 = (0.90 0.20 mg才岫1牛药，其量效曲线形状与阳性对照药磷酸奥司他韦相似，提示二者对NA的抑制可能
2、具有相同的作用方式。采用 质反 应平行线”法设计和优化的板蓝根抗病毒生物效价检测方法，重复性较好(RSD =5.78%,实际样品检测结果均能通过可靠检验(偏离直线P 0.05、偏离平行P 0.05。研究结果表明，所建立的生物效价检测方法可以作为板蓝根品质生物评价的 方法之一。关键词：板蓝根；抗病毒活性；神经氨酸酶；生物效价；品质评价中图分类号：R917文献标识码：A文章编号：0513-4870 (2009 02-0162-05Biological evaluation of Radix Isatidis based onneuraminidase activity assayLI Han-bi
3、ng1,2, YAN Dan1, WANG Jia-bo1, WANG Jing-yan3, BEI Zhu-chun3,WEI Li1,2, XIAO Xiao-he1*(1. Institute of Chinese Medicine, 302 Hospital of People s Liberation Army,Beijing 100039, China; 2. Pharmacy College,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075, China; 3. State Key laborat
4、ory of Pathogen and Biosecurity, Institute of Microbiology and Epidemiology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, ChinaAbstract: Radix Isatidis (Banlangen in Chinese is a traditional Chinese medicinal (TCM herb, and is frequently used for treating influenza. However, the current qua
5、lity control method for Radix Isatidis should be developed since it has little correlation to the pharmacodynamic action. In this paper, the in vitro inhibitory action of Radix Isatidis on neuraminidase (NA was investigated by fluorometric assay with 4-methylumbelliferyl- D-N-acetylneuraminate (FL-M
6、U-NANA method. Based on the method, the experimental condition was optimized and a bioassay statistic method was established according to the reaction type and the regularity of“ parallel lines of qualitative effecoassay ” . Then thmethod of Radix Isatidis was established. This study indicated that
7、Radix Isatidis had obvious in vitro inhibitory activity on NA with IC50 = (0.90 0.20 mg - mL-1 (herb.correlation between logarithmic dose and reaction rate showed anis quite shapesimilar to Tamiflu s reaction curve, which hinted that Radix Isatidis had the same inhibitory function on NA as Tamiflu.T
8、he established bioassay method of parallel lines of qualitative effect” hadreproducibility (RSD =5.78%. The results of potency determination of Radix Isatidis were reliable (reliability test: deviation fromstraight line P 0.05, deviation from parallel line P 0.05 and well regular. As a conclusion, t
9、his bioassay method is suitable to control and evaluate the quality of Radix Isatidis.收稿日期:2008-09-02.基金项目：国家杰出青年科学基金项目（30625042;国家 十一.五”科技支撑计划 课题（2006BAI08B03.*通讯作者 Tel: 86-10-66933322, E-mail: pharmacy302Key words: Radix Isatidis; antiviral activity; neuraminidase; bioassay; quality evaluation板蓝根（
10、Radix Isatidis是常用中药，用于治疗感染性疾病，临床疗效确切，尤其是 抗流感病毒作用被认为是板蓝根的主要药理活性1-6。由于板蓝根化学成分复杂，药效物质不明确，对其质量控制，现版药典7主要以指标性成分精氨酸的薄层检识 为定性依据。但是精氨酸并不是板蓝根的主要药效成分，也不是专属性成分，因此精氨酸的检识对于板蓝根的质量控制并无太大意义。当前 ，建立与药效相关的中药质 量生物控制模式和方法已经成为中药质量控制研究和发展的趋势8,9o优选和建立适宜的抗病毒效价检测方法用于板蓝根质量控制和品质评价，可以体现板蓝根功效 特点，补充和完善以指标性成分检测为主的质控模式的不足。底物荧光检测法（F
11、L-MU-NANA method是流感病毒神经氨酸酶（NA活性体外 检测方法之一。由于NA是影响流感病毒复制、感染和致病的关键酶，NA抑制剂 可以通过抑制NA活性而有效地控制流感症状和疾病的传播10, 11,因此近年来 NA活性荧光检测法已发展为抗流感病毒药物（包括植物药的筛选和活性评价的重 要方法12 o本文采用底物荧光法检测了板蓝根体外抑制NA的生物活性，并按照生物效价检测的要求设计和优化试验条件，建立了基于流感病毒神经氨酸酶活性检 测的板蓝根品质生物评价方法。材料与方法药材及试剂板蓝根药材共10批（上述样品按产地分别采自河北玉田、河北祈 新、河南原阳、甘肃陇西各1批，安徽阜阳某GAP基地
12、产品4批以及安徽亳州市场 购得过期变质样品2批，经解放军中药研究所肖小河研究员鉴定均为十字花科（Cruciferae植物法蓝（Isatis indigotica Fort.的干燥根。阳性对照药：磷酸奥斯他韦 （Tamiflu 胶囊,批号：B1212, Roche Pharma （Schwei公司。工作对照品：取板蓝根对照药材（中国药品生物制品检定所，采用乙醇提取法制 成提取物（收率7.70%作为工作对照品。NA 底物：4-methylumbelliferyl-N-acetyl- o-D-neural- minic acid （MUNANA, Sigma公司。乙基苯基聚乙二醇（Nonidet P
13、-40, NP-40, Fluka公司；DMEM培养基（GIBCO公 司；MES 缓冲齐1J （2-morpholinoethanesulfonic acid, Sigma公司；其余为分析纯。主要仪器荧光酶标检测仪，FLUOstar OPTIMA,德国BMG公司；II型生物安全 柜，NUAIRE公司；恒温CO2细胞培养箱，MCO-15AC,日本SANYO公司；倒置显微 镜，CK40-F200,日本OLYMPUS公司；96孔荧光酶标板，美国COSTAR公司。细胞系、病毒株及NA MDCK细胞由军事医学科学院微生物传染病研究所冻 存;流感病毒（A/PR8/34由军事医学科学院微生物传染病研究所保存
14、。NA的制备：进行细胞传代培养并接种病毒，待细胞完全被感染病变后取滤除细 胞的病毒液，加NP-40灭活，0.22 磁器滤过后分装，作为NA的原酶液，于30 C 冻存备用13 oNA荧光检测原理化合物 MUNANA是NA的特异性底物，在NA作用下的产物 4MU （7-hydroxy- 4-methylcoumarin, C10H8O3 在 355 nm入射波长激发下,可以产生 460 nm荧光，通过检测荧光强度的变化，可以灵敏地反应出NA活性14;同样，如果 反应体系中加入能够干扰NA活性的药物，则荧光值会相应减弱，从而该物质的NA 抑制活性就能通过荧光值的强弱变化被检测出来。反应条件和参数设定
15、参考已广泛应用的 NA抑制剂筛选方法13-15,反应在96 孔板中进行，首先加入稀释的原酶液25仙冰口样品溶液25 pL空温下作用30 min后 加MUNANA 5小L, 37 C孵育60 min后加入终止液（0.1 mol L-1氨酸，以25%乙 醇配制，1% NaOH调pH 10.7 200 跳止反应。测定荧光强度值,设置激发波长： 355 nm,发射波长:460 nm,检测温度37 C。供试品溶液的制备取板蓝根药材粗粉加乙醇超声处理1 h,滤过，取续滤液，回收乙醇并干燥，加水适量使溶解，微孔滤膜（0.22小流过，取续滤液按1 : 0.6倍剂距等 比稀释成一定浓度的供试品溶液。另取工作对照
16、品制成50 mg-mL-1的对照品溶液，与供试品相同的剂距稀释成工作对照品溶液。样品浓度设置及加样分组根据预试验，通过比较对照品（S与被检样品（T的反应 率估算被检品的效价（A T,在线性范围内调整被检样品浓度使与对照品活性接近 ，用 概率单位法在50%反应率上下设相同的浓度梯度。为便于活性比较，同时设样品结果1板蓝根抑制NA活性检测和量效关系考察板蓝根有体外抑制NA的药理活性IC 50 = （0.90 0.20 mg - mL-1（生药,并且量效曲线形状与阳性对照药磷酸奥斯他韦相同（图1图3,提示两者作用趋势和规律相同。反应率与对数剂量之间呈良好的对称“S形曲线，反应率转换成概率单位(Y后，
17、对数剂量与概率单位呈直线关系,在4.88 X 10-225.0 mg mL-1剂量内,回归方程 Y = 8.725 9 + 1.216 9X(X代表对数剂量。说明此反应类型适合用生物检定中质反应平行线测定”法进行效价测定160Figure 1 Dose-effect relationshipFigure 2 Lgdose-effect relationship2数据处理与效价计算2.1反应率反应率（抑制率的几率单位以及半数有效量IC 50 （采用正规Bliss 法均由DAS ver 1.0软件计算完成。计算公式：100%措宛荧景酶活性对照荧光样品作用后荧光酶活性对照荧光IR X -=Figur
18、e 3 Linear relationship of Igdose-probit2.2效价计算约定工作对照品的效价（P S为0.077 U mg次药，根据平行线 测定原理采用 质反应的平行线测定法进行样品与对照品效价 的对比检定。具体运 算过程及结果的表不见下表（表1、2。表1中，首先将对照品（S和被检样品（T的剂量及反应率输入对应数据栏，由 DAS ver1.0软件计算概率单位（Y j、权重（nW等中间结果。S和T校正直线的回 归方程由（X X b Y Y-+=求得（式中Z2 二nW nWX X , E=nW nWY Y , EE =XXXY SS b o而后经过连续校正和可靠性检验，样品效
19、价由公式P T = R PS计算求得（bY Y X X R TS 1g -=,P S为对照品的效价。表2中，A T为估计效价,可靠性检验(偏离直 线 0.05，偏离平行 0.05说明S 与T量效线性良好，且呈平行线关系，通过可靠性检验，对比检定所得到的效价结果 准确可信。效价以P T和FL%表示(P T为效价中间值，FL%为结果的可信限率。3方法学 考察3.1 精密度按上述条件，取同一份板蓝根样品的供试液，分5次点样于96孔板 中参与酶促反应，结束后与工作对照品溶液进行对比检定，计算效价的变异系数。结 果 RSD 为 3.83%。3.2 重复性同一批样品分5次提取，制成供试品溶液，按上法与工作
20、对照品溶液 进行对比检定，计算效价的变异系数。5次测定的效价RSD为5.78%,该方法具有较 好的重复性。3.3 稳定性 分别于0、1、2、3和4 h将保存于4 C的同一供试品溶液进行效价 检测，其RSD为4.75 %,表明供试品溶液在4 c条件下保存4 h是稳定的。Table 1 Data of inputting and operating(D (X (P % probit (Y e probit (Y (Y j (nW probit (Y r (Y r-Y 8.75 0.94 65 5.395.39 5.39 60.22 5.39 2.97 EE46.12 0.79 55 5.13 5.
21、11 5.12 63.37 5.11 1.015)44.29 0.63 43 4.82 4.83 4.82 63.03 4.83 -9.52E -05Work referencesubstance (s3.000.48334.564.564.5659.264.56291E 4SUM 2.84 19.89 245.8810.50 1.02 65 5.39 5.42 5.38 59.64 5.422.85E-06 7.35 0.87 59 5.23 5.20 5.2362.69 5.21 -1.43E -06 5.14 0.71 52 5.05 4.99 5.05 63.66 4.997.33E
22、-09Test sample (T3.600.56394.72 4.774.7262.454.771.42E -06SUM3.1620.38 248.44Table 2 Form of resultsA TDeviation from straight lineDeviation from parallel lineRFL R FL ave FL% P T21 0.990.460.99 0.77-1.340.28 28.43 20.92Table 3 Determination results of sample aReliability testNo. Source P T /U - g -
23、1FL/% straight lineparallel line01 Yutian, Hebei 23.07 32.51 0.98 0.81 02 Qixin, Hebei22.52 28.050.99 0.43 03 Yuanyang, Henan 29.55 27.85 0.99 0.27 04 Longxi, Gansu 30.48 27.81 0.99 0.84 05b Fuyang, Anhui 1 29.01 31.31 0.98 0.67 06b Fuyang, Anhui 2 31.02 31.32 0.99 0.83 07b Fuyang, Anhui 3 29.76 19.
24、06 0.99 0.76 08b Fuyang, Anhui 4 30.55 28.75 0.98 0.82 09c Bozhou market 1 8.2844.830.49 0.12 10cBozhou market 212.32 31.100.350.62ab method (collected from the same GAP base; cInferior quality samples, identified by routine method (expired samples, got from market3.4不同来源的板蓝根抑制流感病毒神经氨酸酶效价的测定以本文设定的工作
25、对照品为参比，按照上述方法，测定10批板蓝根药材的效价，结果见表3。结果表明不同批次药材效价值存在差异，效价中间值范围为8.2831.02 U - g -1, 高低相差近4倍。其中0508号样品是板蓝根道地产区 GAP基地4个批次产品，常 规鉴别均为优级品，它们抗病毒效价值最高且差异较小(29.0131.02 U - g -1,0910号样品常规鉴别判为劣药,其抗病毒效价值也最低,分别为8.28 U g -1 (FL% = 44.83、12.32 U - g -1 (FL% = 31.10讨论前期研究中，作者在常用的NA活性荧光检测法基础上，系统考察了底物用量、 酶用量、加样量、反应时间等因素
26、，建立了抑制NA活性中药的筛选方法，初步研究 表明板蓝根乙醇提取物具有明显的体外抑制NA活性。本试验进一步证明了板蓝根的抑制NA活性，经过与阳性对照药磷酸奥斯他韦胶囊的对比，表明二者在抑制NA 活性方面具有相同的作用趋势和规律。在此基础上对荧光检测法进行了优化和方法 学考察，并确定了适宜的生物检定统计方法，建立了基于流感病毒神经氨酸酶活性检 测的板蓝根生物效价检测方法，用于板蓝根品质评价。当前,对板蓝根的质量控制方法主要是依托常规性状鉴别和精氨酸的定性检识，该方法既难以彳到客观定量，又与板蓝根的药理活性几无关联，也就难以保证它的临 床有效性。本文结果提示：生物效价检测方法与常规鉴别方法比较不仅
27、在结果上具 有一致性，而且具有灵敏度高、重复性好、操作简单、客观、可定量、快捷等优 点。本方法的建立提高了板蓝根的质量控制水平,并且能够为抗病毒类中药质量生 物控制的研究提供参考。References1Yamada H. Antiviral compositions containing newglycoprotein from Isatis tinctoria: JP, 1160, 599 9960,599 P.1999-03-02.2Lin CW, Tsai FJ, Tsai CH, et al. Anti-SARS coronavirus3C-like protease effects
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