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1、地中海贫血的诊断方法B-地中海贫血的筛查和诊断主要依赖实验室检查，方法主要有：1 血常规检测地中海贫血的重要特征之一是小细胞低色素性贫血，如 MCV 80 fl , MCK 25. 0 Pg,则可疑为地中海贫血患者或基因携带者 ， 可同时测定血清铁和铁蛋白，以排除缺铁性贫血。2 红细胞渗透脆性试验（ 一管法 ）其原理是地中海贫血红细胞膜表面粗糙、凹陷、折叠和浆膜扩展，膜与内容物之比增大，对渗透溶解的抗性增加，在0 32 （ 或0. 36%）NaC1中溶解度降低（脆性降低）。一管法可用于地中海贫血群 体筛查。3血红蛋白（Hb）电泳H曲泳是检测地中海贫血、异常血红蛋白最常用的方法，可观察到HbE、
2、HbH异常血红蛋白区带，同时可定量检测HbR HbA2勺含量并区分常 见类型的地中海贫血。有研究显示MCV Hbfe泳和红细胞脆性实验三 者联合检测的灵敏度可达100 ， 阴性预告值达100 ， 联合特异度可达 100 ，阳性预告值达100 DS。4 高效液相色谱技术（HPLC）原理： 采用微柱法离子交换层析和梯度洗脱技术，全自动分析仪可分离血红蛋白的变异体与亚型，容易发现重型和轻型 B地中海贫 血。在操作上，HPL农用的是全血标本，不需要制备Hb夜，只要将全 血标本直接放在仪器上，通过电脑操作便能实现 HbA HbA2 Hb律定 量检测。优点：所需样本量少，自动化程度高，操作简单，快速，能消
3、除人为误差，结果准确。HPL他可用于胎儿脐带血的产前诊断，可 诊断出重型Bfe中海贫血，但不能区分正常胎儿和杂合子胎儿。近年来，地中海贫血高发地区也采用此法进行携带者检测。5 基因诊断近年来，随着分子生物学研究领域的不断发展， 从最初的B珠蛋白 基因簇限制性酶切多态性检测至目前的聚合酶链反应(PCR肢术结合其他分子生物学方法，Bfe中海贫血的诊断已逐步改进和完善。基因 诊断方法有下列几种：5. 1限制性片段长度多态性连锁分析(RFL唯锁分析)原理：DNAM制性内切酶可识别并切割DNA1特定的核甘酸序列，得到 一定长度的DN附段，而碱基的突变可导致酶切位点的丢失或形成， 从而改变酶切片段的大小。
4、突变基因在经过相应的限制性内切酶水解后， 其电泳条带的数量和大小就会发生改变，根据这些改变可判断出突变是否存在。缺点：由于单独使用该方法，不能直接测出受试者突变基因的类型，必须结合寡核苷酸探针等技术，故其应用范围有一定限制， 且操作繁琐。如果母亲或父亲在所有的多态性位点上都为纯合子， 无法用此方法进行产前诊断，或者患儿和父母所有位点上都是杂合状态，只能进行50 的排除性诊断。5 2 探针斑点杂交技术( allele specific oligonucleotideASO) 应用引物扩增珠蛋白基因，同时合成与正常序列和突变序 列完全互补的寡核甘酸探针。将PCRT增产物点在尼龙膜上，分别与 标记的
5、正常和突变的AS解针杂交，不完全互补的探针，在一定条件下可以完全洗脱，再从放射自显影观察杂交结果。如果两个等位稣蛋白基因正常，仅与正常探针杂交，反之，均带有突变时，则仅与突变探针杂交。这种检测方法快速、灵敏。缺点：对 DNA勺纯度和数量 要求较高，一次杂交能检测一种突变，对于具有高度异质性的B地中海贫血往往需要多次更换探针杂交，才能确定诊断，如使用同位素标记探针，还存在放射性污染等问题。5 3 反向点杂交方法(Reverse dot blot hybridization ， RDB)与传统等位基因特异性寡核苷酸探针点杂交的基本原理相同，所不同的是：将膜上固定探针取代固定靶 DNA经一次杂交就可
6、对未知样品 中多个突变进行检测，改变了传统杂交法一次只能检测一种突变的方式。优点：较快速、敏感，操作简单。缺点：只能检测已知位点突变的B地中海贫血，不能检出未知突变。5 4 缺口 PCR(gap PCR) 原理：设计三个或两对引物，即在缺失区域外侧，靠近缺失位点的位置设计一对引物，另外一个或一对引物在缺失区域内。在缺失区域内的引物能够在杂合子和正常人中扩增出片段，在缺失纯合子中不能扩增。在缺失区域外侧的一对引物，因为缺失使相距甚远的两端DN版进，从而可扩增出特定的DNAt断。 从而检测出纯合子患者，杂合子携带者。Wan筹报道用此方法对89 个稣蛋白基因突变的检测。5 5 扩增不应突变系统(am
7、plification refractorymutationsystems, ARM或称等位基因特异性PCR 原理：在PCR针对某个点突变设计出3端碱基与目的基因的突变碱基互补的引物，PCR反应中， 只有突变的基因才有相应的扩增产物，而正常的基因则不能扩增。从而将正常与突变的DNA：别开来。优点：仅需微量的DN群 品(100400 ng),通过简单的设计，仅需同一种PCR1环体系便可同 时探测常见 稣蛋白基因突变，无需PC更后的分子杂交等过程，不需 限制性内切酶及放射性核素。缺点：特异性较低，易出现假阳性或假阴性。有报道应用该方法进行B地中海贫血的检测。5 6 实时荧光定量PCR(real t
8、ime PCR) 在实验过程的PCR体系中加入荧光集团，由于被测产物的数量与起始模板拷贝数直接相关，具体可以通过特定的定量PC股监测每次循环产生的荧光信号强 度，并参照对照基因的标准曲线来定量，荧光染料能与所有的DNA目结合，不必因为模板不同而特别定制。缺点：由于选取的相对定量和标准曲线本身存在局限性，所得结果存在误差。国内外有报道采用该方法进行B地中海贫血的检测 ?5. 7单链构向多态性PCR(PCRSSCP)与PC瞅合应用，即PCR SSCP 是一种基于单链DNA勾象差别来检测未知点突变的常用 方法。原理：PC衣物在加热或变性剂下生成单链，单个核甘酸的改 变即可造成DN粘断单链的改变。根据
9、构象不同的单链DNA：非变性聚 丙烯酰胺凝胶(PAGE涤件下电泳表现不同的迁移率，电泳带用银染法 显示，无放射性核素污染。可用于检测 B地中海贫血基因缺失的病人 及携带者，是一种筛查未知点突变的有效方法 。缺点：当PC产物小 于200 bp.可检出70%90%的突变率，敏感度随PCR勺长度5 8 等位基因特异性扩增技术(Allele Specific PCR， AS PCR)原理：针对B地中海贫血的突变类型设计特异碱基引物，根据扩增得到的电泳带判断是否存在对应的点突变，结果清晰、准确可靠，尤适用于小片段DNAb析，可作为快速检测携带者的筛查手段。5.9 DN密片技术(DNAchip)以反向斑点
10、杂交为基本原理。将预先设计好的大量核酸探针有序、高密度地显微打印在玻璃片、硅片等固体支持物上，制成DN儆阵列。用荧光标记的待测样品DNAeDNA 或RNAJ位于芯片上的核酸探针杂交后，通过激光共聚焦荧光扫描系 统检测杂交信号强度，用特制的软件对荧光信号进行分析处理，便可得到待测样品的遗传信息或表达信息。优点：高通量，基因诊断可在一张芯片上完成，适用于大面积的筛查。缺点： 设备要求及费用较高，目前难以推广。5. 10 DNAff列测定法(DNA sequencing)常用于分析基因的未知或已知突变。应用PCRT增产物在DNA1动测序仪上进行序列分 析。该法快速、简便、灵敏，重复性好，是基因突变检测的最直接、 最准确的方法。5. 11荧光聚合酶链反应(Fluorescent PCR)荧光PC灌近年 发展起来的新兴技术，它比普通的PCRt感性高出一千倍以上。用不 同颜色的荧光素对PCRT增产物进行标记，在DNAM序仪上同时检测出 不同颜色、不同片段的PCM增产物，从而分辨正常人，杂合子和纯 合子。国外已有报道利用荧光PC检测稣蛋白基因簇大片段缺失 。 而国内应用荧光PCR!行 地中海贫血植入前遗传学诊断，胎儿羊水和脐带血 地中海产前基因诊断，及检测单单细胞Bfe中海贫血基因