质粒DNA提取PPT课件.ppt

1、小规模制备质粒小规模制备质粒DNADNA的技术分析的技术分析 一、一、实验目的实验目的(1)(1)学习小规模制备质粒学习小规模制备质粒DNADNA的技术的技术 。二、二、实验原理实验原理质粒质粒(Plasmid)(Plasmid)：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链因子。是一种环状的双链DNADNA分子。分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。在细菌细胞中最多。细菌质粒细菌质粒:细菌质粒是用的最多的质粒类细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从群

2、其大小从1Kb-200Kb，它们复它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组制时利用宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组酶系。的同一组酶系。严谨型：严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；松驰型：松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成如果用一定的药物处理抑制寄主

3、蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。才能达到更高拷贝数。质粒类型：质粒类型：载体载体(Vector)(Vector)：用于携带重组用于携带重组DNADNA，并且能够使外源并且能够使外源DNADNA一起复制一起复制与表达的质粒与表达的质粒(运载工具运载工具)。具备的条件：具备的条件：易于鉴定；易于鉴定；在受体细胞中可以独立复制；在受体细胞中可以独立复制；易于筛选；易于筛选；易于导入受体细胞。易于导入受体细胞。1.1.抗性基因（抗性基因（Ant

4、ibiotic resistance Antibiotic resistance gene,such as gene,such as AmpicillinAmpicillin resistance gene,resistance gene,KanamycineKanamycine resistance gene)resistance gene)2.2.启始复制子（启始复制子（oriori,Origin of,Origin of replication)replication)；3.3.多克隆位点多克隆位点(MSC,Multiple cloning(MSC,Multiple cloning si

5、te or site or polylinkerpolylinker)；4.4.标记基因标记基因(Marker gene,such as(Marker gene,such as LacZLacZ gene)gene)。载体的结构：载体的结构：InsertEcoRIXhoI1.9kb三三.质粒提取的思路质粒提取的思路n质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNAn要去除的物质：要去除的物质：蛋白蛋白 基因组基因组DNA 脂类及小分子杂质脂类及小分子杂质 RNA DNA DNA 是具有一定结构的物质，一些特殊的环是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致境会导

6、致DNADNA的的变性，如加热、极端变性，如加热、极端pHpH值、值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使境又可以使DNADNA复性。复性。原理：原理：质粒DNA的提取方法n方法：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法；酸酚法等。概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理n所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需)n碱变性法提取碱变性法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在主要是利用共价闭合环状质粒

7、与线性染色质在拓扑学上的差异：拓扑学上的差异：n在在pH 12.0-12.6碱性环境碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态；仍为自然状态；n将将pH调至中性并有高浓度盐存在的条件下，染色体调至中性并有高浓度盐存在的条件下，染色体DNA之之间交联形成不溶性网状结构，大部分间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。通过离仍为可溶状态。通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、R

8、NA及蛋白质，及蛋白质，质粒质粒DNA尚在上清中，尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。n由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，

9、质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。四、实验步骤四、实验步骤接含接含PUC18(PUC18(或或pET21a)pET21a)质粒的单菌落于质粒的单菌落于LB AmpLB Amp+液体培养基中液体培养基中37370 0C C，190rpm190rpm振荡培养过夜振荡培养过夜取取1.5菌液入菌液入1.5ml的的dorf管中管中10000rpm10000rpm、离心离心1min1min，弃上清，收集菌体弃上清，收集菌体100uL100uL溶液溶液I I悬浮菌体（悬浮菌体（轻轻混匀轻轻混匀），室温（或冰浴），室温（或冰浴

10、2min2min加入加入2 250uL50uL溶液溶液IIII（轻轻混匀轻轻混匀,反复反复4-6次次），室温静置），室温静置1min1min，裂解，裂解菌体菌体加入加入150uL150uL溶液溶液IIIIII（轻轻混匀轻轻混匀），室温静置），室温静置,冰上放置冰上放置5min5min，质粒，质粒DNADNA复性复性1 12000rpm2000rpm，离心离心1 15min5min，将上清转至另一离心管中备用将上清转至另一离心管中备用向上清中加入等体积氯仿向上清中加入等体积氯仿/异戊醇（异戊醇（24:1）（去蛋白），反复混匀，）（去蛋白），反复混匀，10000rpm，离心离心10min，将上清

11、转至另一离心管中备用将上清转至另一离心管中备用向上清加入向上清加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置倍体积乙醇，混匀后，室温放置1520min12000r/min离心离心 10 min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。用用500 L 70%乙醇洗涤质粒乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。气中干燥。加入适量（加入适量（30 L）的）的TE其中含有其中含有20 ug/ml的的RNA酶，使酶，使DNA完全溶解完全溶解20保存。保存。原理示意图原理示意图相关原理n相关原理

12、解释溶液I的作用n控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。n葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。q如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。nEDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。n如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。n如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽

13、提质粒呢？n实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。n有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有能有结块。溶液IIn用新鲜新鲜的0.4N的NaOH和2的SDS等体积混合后使用的。n要用新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。nn破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。q细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。溶液IIn为什么要加SDS呢？n那是为下一步操作做的铺垫。n这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时

14、候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。溶液IIIn加入后就会有大量的沉淀。n溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。n大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，q让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。q因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。溶液IIIn醋酸又是为什么而加的呢？n是为了中和NaOH，因

15、为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。n基因组DNA一旦发生断裂，只要是50100kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。溶液IIIn溶液III加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点。n不要以为PDS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能被沉淀。q因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，q然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA，q不然时间一长就会因为混入的DNase而发生降解。酚/氯仿n酚（Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿n水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相

16、的回收；n但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；酚/氯仿n还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），n因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。乙醇n回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。q如果感觉发生了盐的沉淀，就用70的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，并用tip将沉淀打碎，

17、就能得到好的样品。RNasen得到的质粒样品一般用含RNase（50ug/ml）的TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的。核酸电泳与感受态细胞的制备实验目的实验目的一、初步掌握琼脂糖凝胶电泳的方法及原理一、初步掌握琼脂糖凝胶电泳的方法及原理二、掌握氯化钙法制备感受态细胞的方法二、掌握氯化钙法制备感受态细胞的方法1琼脂糖凝胶电泳技术n核酸分子是是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液中，其碱基不解离，而磷酸基团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移。琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰，为一种聚合链线性分子，使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功

18、能，使得大小和构象不同的n核酸分子的迁移率出现较大差异，从而达到分离的目的。琼脂糖凝胶电泳操作简单、快速，通过调整其使用浓度，使得分辨率达到大多数实验的要求，因此成为分离、鉴定、纯化核酸分子的常用方法。但操作过程中仍有不少要注意的问题。1.1琼脂糖凝胶的特点n1.1.1操作简单,电泳速度快,样品不需事先处理n1.1.2结构均匀,含水量大(约占98%-99%),近似自由电泳,样品扩散较自由电流,对样品吸附极微,因此电泳图谱清晰，分辨率高,重复性好n1.1.3琼脂糖透明无紫外吸收,电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定n1.1.4电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保

19、存.核酸相对分子量质量及分子构型核酸相对分子量质量及分子构型 凝胶的浓度凝胶的浓度1.2.1 核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系DNA分子的大小在凝胶中，DNA片段迁移距离（迁移率）与与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。1.2DNA的琼脂糖凝胶电泳 1.2.21.2.2、核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系、核酸构型与琼脂糖凝

20、胶电泳分离的关系 不同构型DNA的移动速度次序为：共价闭环DNA直线DNA开环的双链环状DNA。当琼脂糖浓度太高时，环状DNA（一般为球形）不能进入胶中，相对迁移率为0（Rm=0），而同等大小的直线双链DNA（刚性棒状）则可以长轴方向前（Rm0），由此可见，这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。1.2.3 1.2.3 琼脂糖浓度与琼脂糖浓度与DNADNA分离范围分离范围琼脂糖浓度/%0.30.60.70.91.21.52.0线状DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.11.3电泳方法1.3.1 凝胶类

21、型凝胶类型 用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型(平板型).水平型电泳时,凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下1-2mm,故又称为潜水式。后者制胶和加样比较方便,电泳槽简单,易于制作,又可以根据需要制备不同规格的凝胶板,节约凝胶,因而较受欢迎。1.3.2 缓冲液系统缓冲液系统 缺少离子时,电流电流太小,DNA迁移慢;相反,高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热,严重时,会造成胶熔化和DNA的变性。常用的电泳缓冲液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TEA），Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，浓度约为50mmol/L(pH7.57.8)。电泳缓冲液一般都配制成浓的

22、贮备液，临用时稀释到所需倍数。TAE缓冲能力较低，后两者有足够高的缓冲能力，因此更常用。TBE浓溶液长期贮存会出现沉淀，为避免此缺点，室温下贮存5溶液，用时稀释10倍0.5工作溶液即能提供足够缓冲能力。1.3.3 凝胶的制备凝胶的制备 以稀释的电极缓冲液为溶剂,用沸水浴或微波炉配制一定浓度的溶胶,灌入水平胶框或垂直胶膜，插入梳子,自然冷却。1.称取一定量琼脂糖凝胶，按1g中100ml的量加入电泳缓冲液，微波炉中加热约2min，使琼脂糖溶解；2.溶液冷至60，加入EB至终浓度为0.5g/ml，混匀，注意戴手套操作；3.将琼脂糖倒入电泳板中，使凝胶厚度约为0.3-0.5cm，迅速插上梳子，检查有无

23、气泡；4.待凝胶完全凝固后（约30min），小心取出梳子，将凝胶板置于电泳槽中，加入电泳buffer，让液面高出胶面1mm；1.3.4 样品配制与加样样品配制与加样 DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解,缓冲液内含有0.25%溴酚蓝或其他指示染料,含有10%-15%蔗糖或5%10%甘油,以增加其比重,使样品集中。上样缓冲液中一般加了两种指示剂,溴酚兰和二甲苯青(值得注意的是是指示剂并非染色剂,DNA染色剂是是溴化乙锭,而且要在紫外光的激发下才能看见桔红色荧光)。上样缓冲液储存液一般为6(10),表示其浓度为工作浓度的六倍。使用时上样缓冲液应稀释到一倍浓度。1.3.5 1.3.5 电泳电

24、泳 琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明，在低浓度、低电压下，分离效果较好。在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。但是，在电场强度增加时，较大的DNA片段迁移率的增加相对较小。因此随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不宜高于5V/cm。电泳系统的温度对于DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响。通常在室温下进行电泳，只有当凝胶浓度低于0.5%时，为增加凝胶硬度，可在4进行电泳。电泳时间一般为3O60 min。1.3.6 1.3.6 染色和拍照染色和拍照 常用荧光染料溴乙锭（EBEB）染色，在紫外光下观察DN

25、A条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数据分析。1.4结果分析1.4结果分析1.DNA 相对分子量标准物（marker);2.pUC19 质粒 DNA 经EcoR 完全酶切；3.pUC19 质粒 DNA 经EcoR 部分酶切；4.自提pUC19 质粒 DNA（此效果提得较好，为1带，以超螺旋质粒DNA为主。有时是3条带，分别为超螺旋质粒，线状质粒和开环质粒。还有时结果为2条带）n感受态细胞（competentcell）：理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。CaCl2法：n1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造

26、成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞n细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基磷酸钙复合物。n2.此时，将该体系转移到42下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。n3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。n意义：n将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以

27、检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。2感受态细胞的制备75mMmol/L CaCl75mMmol/L CaCl2 2 溶液溶液:称0.56gCaCl2(无水分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,用0.22m滤器过滤除菌or高压灭菌。EP管分装于0冰箱储存。受体菌的培养受体菌的培养:从平板上挑取新的活化后的E.coli TG1单菌落,接种于5mlLB液体培养基中,37下振荡培养12小时左右,取50ul培养液转入5mlLB中,37振荡培养1-1.5小时至对数生长期OD600=0.5左右。感受态细胞的制备步骤：感受态细胞的制备步骤：改变细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA的载体分子通过n、将培养液10ml转入离心管中,冰上放置10-20分钟。n、置于4,5000rpm离心5分钟,倒尽上清。n、添加一半菌液体积(750ul)预冷的75mM的CaCl2,用枪轻轻吹打,使细胞悬浮,冰上放置30分钟。n、4,5000rpm离心8分钟，弃上清。n、再加入200ul预冷的75mM的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置备用。0，4h后可用。新鲜的感受态细胞在4-24小时之内可直接用于转化,也可加入总体积15%的无菌甘油,混匀后置于-70可保存6个月,转化效率基本不变。