《酶活力测定方法课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《酶活力测定方法课件.ppt（23页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、酶活力测定方法,1,2酶活力测定法 1）基本原理： 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力测定实质上是测定一个被酶所催化的化学反应速度。酶反应速度越快所表示的酶活力越高。,酶活力测定方法,2,酶反应速度可以用单位时间反应底物的减少或产物的增加来表示。 通常酶活力测定时，先制备酶反应进程曲线和酶浓度曲线。通过酶反应速度的测定，求得酶的浓度或含量。,酶活力测定方法,3,酶反应进程曲线 纵坐标为底物或产物的变化量，横坐标为反应时间，曲线斜率表示反应速度。从酶反应进程曲线求得反应的初速度。酶浓度曲线 纵坐标为反应速度，横坐标为酶量。通过酶浓度曲线检验反应测定系统是否适宜。,酶活力测定方法,4,酶活
2、力测定方法,5,酶活力测定的要求：测得的反应速度必须和酶浓度有线性的比例关系，这也是检验酶反应和测定系统是否适宜、正确的标准。,酶活力测定方法,6,2）酶促反应的条件及影响因素 底物的浓度：一般选用底物的浓度S=100Km。 pH：选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、 适宜的pH值的缓冲系统来控制pH。 温度：酶反应的温度通常选用25、30或 37，实验中温度变动应控制在0.1以内。 辅助因子：有些酶需要金属离子，有些需要 相应的辅酶。,酶活力测定方法,7,空白和对照试验： 空白试验：是指杂质反应和自发反应引起的变化量，它提供的是未知因素的影响。空白值可以通过不加酶，或不加底物，或二者都加（酶预
3、先经过失效处理）。 对照试验：是指用纯酶或标准酶制剂测得的结果，主要作为比较或标定的标准。,酶活力测定方法,8,3）测定方法： 取样测定法：,酶活力测定方法,9,连续测定法：在反应过程中对反应系统进行直接连续检测。检测方法：紫外-可见分光光度法 旋光法荧光分光光度法 电化学测定法 酶偶联测定法 离子选择性电极测定法等。,酶活力测定方法,10,示例：胰蛋白酶效价测定胰蛋白酶 肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸）水解速率：酯键酰氨键肽键供试品溶液：5060单位/ml底物溶液：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯 浓度：A：0.575.0585N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯 N-苯甲酰-L-精氨酸,酶活力测定方法,1
4、1,253nm处的A随酶促反应递增，根据酶活力单位定义计算酶活力。,酶活力测定方法,12,酶活性单位：在最适的条件下，每分钟能转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性单位。测定：空白：底物溶液 + 0.001mol/L HCl,酶活力测定方法,13,每30s A的改变：0.0150.018，呈线性关系的时间不得少于3min。,酶活力测定方法,14,A每分钟改变0.003，相当于1个胰蛋白酶单位。 供试液的A每分钟改变,酶活力测定方法,15,相当于的单位数为每mg供试品中含胰蛋白酶单位数为,酶活力测定方法,16,重组人白细胞介素 11的胰蛋白酶切肽图分析 肽图分析是评价重组产品蛋白质结构及其生产工艺
5、稳定性的重要方法,目前常用的方法有裂解-微量肽图法和胰蛋白酶切 肽图法。,酶活力测定方法,17,1。酶切条件 取浓度为3-1的样品0 4对1%43充分透析,然后取透析样品250至微量进样瓶,加0 3-1处理的胰蛋白酶10混匀,于37温控自动进样器酶切,每80进样一针,进样量6,用32色谱软件选择214进行分析,直至 11完全酶解。按此方法摸索最佳酶切时间,在第14针后 11已被完全酶切,酶切时间在1822范围内肽图图谱基本一致,即确定最佳酶切条件为37保温20。,酶活力测定方法,18,2。系统测试 系统测试标准物质进样后呈3个峰,12次重复进样3个峰保留时间的分别为0. 4%,0 .6%和0.
6、 8%,峰面积的分别为0 .7%,0 .8%和0 .8%。 11对照品37酶切20后于4温控自动进样器连续进样5次,结果见图1。5个色谱图完全重叠在一起,所产生21个峰的保留时间、峰高和峰面积的均分别小于1 .0%,5 .4%和9. 8%,表明本系统误差小,重复性好,可用于11的肽图分析。,酶活力测定方法,19,酶活力测定方法,20,酶活力测定方法,21,3批 11制品的 图谱完全一致,说明该厂 11的生产工艺是稳定的;与公司生产的 11对照品比较有20个峰与对照品一致,但第6 峰的峰高和峰面积均明显较小,且在第9和第10 峰之间多一个峰,说明该厂 11蛋白质结构与公司生产的 11比较存在细小差别。,酶活力测定方法,22,返 回,酶活力测定方法,23,练习与思考,1何谓：生化药物、生物技术药物、基因工程药物和生物制品？2生化药物和基因工程药物各分哪几种？3与化学合成药物的分析相比，生物药物的分析有何特点？,返 回,