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1、酶抑制法,第七章 残留农药的检测方法 -酶抑制法,酶抑制法,实际上，最容易引起农药食物中毒的当属有机磷类杀虫剂。我国专家江希流曾对为数众多的农药品种进行过分级排队，从中筛选出了十种强污染的农药，其中有七种为有机磷类，即敌百虫、敌敌畏、乐果、氧化乐果、对硫磷、甲基对硫磷、甲胺磷，其他三种为杀虫双、杀虫眯和除草醚。 氨基甲酸酯类农药毒作用机理与有机磷农药相似，主要是抑制胆碱酯酶活性.,酶抑制法,二、检测原理,利用有机磷和氨基甲酸酯类农药对动物体内乙酰胆碱酯酶（ AChE ）具有抑制作用的原理，在乙酰胆碱酯酶及其底物（乙酰胆碱）的共存体系中加入农产品样品提取液（样品中含有水），如果样品中不含有机磷或
2、氨基甲酸酯类农药，酶的活性就不被抑制，乙酰胆碱就会被酶水解，水解产物与加入的显色剂反应就会产生颜色；反之，如果试样提取液中含有一定量的有机磷或氨基甲酸酯类农药，酶的活性就被抑制，试样中加入的底物就不能被酶水解，从而不显色。,酶抑制法,水解,加酶,显色剂,未水解,显色剂,不显色,显色,无农药,有农药,酶抑制法,用目测颜色的变化或分光光度计测定吸光度值，计算出抑制率，就可以判断出样品中农药残留的情况。 AChE 属于丝氨酸为中心的酶类，羧酸酯酶（非特异性酯酶的一种）与 AChE 类似，同样以丝氨酸残基作为活动中心。,酶抑制法,三、酶的基质和显色反应类型,1.酶的基质酶抑制剂显色反应可使用的基质（底
3、物）和显色剂很多。各种乙酰胆碱（ ACh ）、乙酰萘酯以及其他羧酸酯、乙酸羟基吲哚及其衍生物 考虑：灵敏度，适用性，酶源、基质、显色剂获得难易,酶抑制法,1. 肉眼观察法酶片法、试纸法、速测卡法基于反应体系反应前后明显的颜色变化来观察、判断农药毒性高低的一种定性测量方法。一般选用靛酚乙酸酯（红色）为底物。,四、检测方法,酶抑制法,原理是：胆碱酯酶可催化靛酚乙酸酯（红色）水解为乙酸与靛酚（蓝色），有机磷或氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶有抑制作用，使催化、水解、变色的过程发生改变，由此可判断出样品中是否含有有机磷或氨基甲酸酯类农药。美国于 1985 年曾报道了一种称为农药检测器的酶片，可在田间快速检测
4、有机磷和氨基甲酸酯类农药，其灵敏度在 0.110mg / kg 范围。,酶抑制法,速测卡法华南农大植保系和深圳天福贸易有限公司推出的“农药速测卡”广州进出口食品检验研究中心与广州天河绿洲生物化学研究中心联合研制生产的“农药检测卡”,酶抑制法,速测卡以滤纸作载体，白纸片上载有乙酰胆碱酯酶和基质，红纸片载有显色剂。 当空白样品加于白纸片上，在酶作用下，乙酰胆碱与水发生水解，水解产物与显色剂反应产生颜色。当含有有机磷和氨基甲酸醋类农药的样品加于白纸片上时，抑制了乙酰胆碱酯酶的活性，使这种酶不能被水解，从而无显色反应。,酶抑制法,白色药片变成蓝色，说明农药残留无或在检出限下；白色药片不变蓝，说明含有超
5、出检出限的农药。,酶抑制法,酶抑制法,农药速测卡对几种常用农药的最低检测限（单位mg/kg）如下：甲胺磷 1.7 马拉硫磷 2.0 水胺硫磷 3.1 对硫磷 1.7 久效磷 2.5 乙酰甲胺磷 3.5 敌敌畏 0.3 乐果 1.3 敌百虫0.3 呋喃丹 0.5 西维因 2.5 好年冬 1.0,酶抑制法,（1）整体测定法选取有代表性的蔬菜样品，擦去表面泥土，剪成 1cm 左右见方碎片，取 5g放入带盖瓶中，加入 10ml 纯净水或 0.1mol /L pH7.5 的磷酸缓冲液 水与菜叶的比例以 ( 1 : l ) ( l :2 ）为宜 ，震摇 50 次，静置2min 以上。取一片速测卡，用白色药
6、片蘸取提取液，放置 10min 以上进行预反应，有条件时在 37 恒温装置中放置 10min 。预反应后的药片表面必须保持湿润。将速测卡对折，用手捏 3min 或用恒温装置恒温 3min ，使红色药片与白色药片叠合发生反应。每批测定应设一个纯净水或缓冲液的空白对照卡。,酶抑制法,（2）表面测定法擦去蔬菜表面泥土，滴 2 3 滴洗脱液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液处轻轻摩擦。取一片速测卡，将蔬菜上的液滴滴在白色药片上放置 10min 以上进行预反应，有条件时在 37 恒温装置中放置 10min 。预反应后的药片表面必须保持湿润。将速测卡对折，用手捏 3min 或用恒温装置恒温 3min ，使红色
7、药片与白色药片叠合发生反应。每批测定应设一个洗脱液的空白对照卡。,酶抑制法,速测卡使用经验 : 由于菜叶含有大量的叶绿素，若菜叶剪得太碎，叶绿素颜色会对阴性反应的蓝色观察有影响，对农药速测卡的初次使用者易产生错误的判断。 可疑阳性试样是根据显色反应的蓝色比空白浅，比阳性深而判定的。蓝色变浅程度存在差异，且有部分叶绿素的影响，,酶抑制法, 农药速测卡使用的最佳 pH 值是 7.5 ，若样液的 pH 值偏离太大，会产生错误的结果。 应用农药速测卡时，反应的温度和时间对显色有影响，必须同时进行空白对照。,酶抑制法,试纸法（速测卡法）操作简单、成本低，但对于深颜色样品的检测， 实验误差较大，而植物酶片
8、用于植物样品检测时也存在基体干扰问题，操作者人为因素较大，灵敏度较低，只能勉强算是一种定性方法。,酶抑制法,2.比色法检测箱法、酸碱指示剂法、试剂盒法、速测灵法 检测原理:利用有机磷和氨基甲酸酯类农药对动物和昆虫的毒性作用是通过特异性抑制胆碱酯酶（ ChE ）来实现的，但结果的判定是根据比色管溶液的变化通过目测比色来完成的。,酶抑制法,振荡12min,抑制反应,酶抑制法,我国农业部农药检定所利用酶抑制产生的显色反应，通过分光光度计比色测定酶的抑制率，以测定有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量。,酶抑制法,酶抑制法只能检测对 AChE 具抑制作用的有机磷和氨基甲酸酯类农药，对其他类型农药造成的污染则无
9、法检出，而且方法的灵敏度通常较低，如对伏杀磷、水胺硫磷、涕灭威，有时还有假阳性。,酶抑制法,五、酶源种类与酶液制备,1 酶源的种类酶源选择是生物酶技术应用的基础，其性质的好坏、特异性大小、稳定与否直接关系到检测的结果。各种农药对一些酶的活性均有不同程度的抑制作用。常用的酯酶： 动物（牛、猪、绵羊、猴、鼠、兔或鸡）的肝脏酯酶； 人血浆或血清；,酶抑制法, 马血清或黄鳝血中的胆碱酯酶； 蜜蜂或蝇头的脑酯酶； 动物（兔、牛、鼠）的羧酸酯酶。肝酯酶和植物酯酶应用较少，常用的是脑酯酶和血清酯酶。,酶抑制法,六、酶抑制技术存在的问题,酶抑制法就是根据酶的活性受有机磷和氨基甲酸酯类农药的抑制而降低的原理进行检测的。酶抑制法具有操作简便、快速、不需要昂贵的仪器设备、测定方法易于掌握等优点，特别适于现场检测及大批量样品的筛选。,酶抑制法,酶抑制法中酶最为关键，酶的种类决定着检测的灵敏度。酶抑制法测定农药残留所用的酶包括乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶、动物与植物酯酶，其中乙酰胆碱酯酶应用较多，乙酰胆碱酯酶对有机磷农药较敏感，测定的灵敏度高，选择性强。,