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1、实验一蛋白质分子量的测定一一凝胶层析法；一、实验目的；1.掌握凝胶层析的基本原理；2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实；二、实验原理；凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大；将凝胶装在柱后， 柱床体积称为“总体积”，以 Vt表；式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起， 到组分最大；上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶；如果假定蛋 白质实验一 蛋白质分子量的测定一一凝胶层析法一、实验目的1. 掌握凝胶层析的基本原理。2. 学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。二、实验原理凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定 相的层析技术
2、。当混合物随流动相经过凝胶层析柱时， 其中各组分按其分子大小 不同而被分离的技术。该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。 凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致， 像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而 大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此 类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。大 分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱； 而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品
3、中不同大小的分子彼此获得分离。 若分 子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质， 则居二者之间从柱中流出。总 之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子， 最终由于它们被排阻和扩散的程度不 同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以 Vt 表示。实质上 Vt 是由 V i与Vg三部分组成，Vo称为“孔隙体积”或“外水体积”，即存在于柱床内凝 胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积； Vi 为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。Vg为凝胶本身的体积。洗脱体积（Ve）与Vo与Vi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo
4、+KdVi式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所 流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说 Kd是分子量不同的 溶质在凝胶内部与外部的分配系数。 它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗粒 孔隙的大小分布有关，而与柱的长度粗细无关，也就是说它对每一物质为常数， 与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得，上式可以改写为：Kd=（Ve-Vo）/Vi上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶 液（最好是有颜色以便于观察，如血红蛋白，印度黑墨水，分子量约 200 万的蓝 色葡聚糖-2000等）通过实际测量求得；Vi可由gx Wr求得（g为干
5、胶重量，单 位为克；Wr为凝胶的“吸水量”，以毫升每克表示）。因此，对一层析柱胶床 来说，只要通过实际实验得知某一物质的洗脱体积就可算出它的Kd值。如果假定蛋白质分子近于球形， 同时没有显着的水合作用， 则不同大小分子 量的蛋白质， 在洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量有直接的定量的关系。 在 一根凝胶柱中，凝胶颗粒间空隙所含水相体积为外水体积 Vo,不能进入凝胶孔 径的那些大分子，当洗脱体积为时 Vo,出现洗脱峰。凝胶颗粒内部孔穴的总体积为内水体积 Vi ，能全部渗入凝胶的那些小分子，当洗脱体积为Vo+Vi时，出现洗脱峰。Ve与分子量的关系：对同一类型的化合 物，洗脱特性与组分的分子量有关，
6、流过凝胶柱时，按分子量大小顺序流出，分 子量大的走在前面。Ve与分子量的关系可用下式表示：Ve=K1-K2logM式中M为 相对分子质量，K1和K2为常数,Ve也可用Ve-Voo葡聚糖凝胶有不同的型号，用于分离不同相对分子质量大小的物质。例如 Sephardex G-75的分级范围是3000-80000的球形分子。在本实验中用于分离蓝 色葡聚糖和牛血清蛋白、胃蛋白酶、 CytCo三、仪器和试剂仪器: 层析柱核酸蛋白检测器（或紫外分光光度计）、自动部分收集器、刻度管试剂：蓝色葡聚糖2000、Sephardex G-75、洗脱液：LTris-HCL-KCL,待测样品 ： 蓝色葡聚糖、牛血清蛋白、胃
7、蛋白酶、 CytC四、实验步骤1 凝胶溶胀凝胶颗粒要求大小比较均匀 ，可流速稳定，结果较好。取葡聚糖 Sephardex G-75 干粉，加过量的蒸馏水室温充分溶胀一天（溶胀时间因凝胶交联度不同 而不同），或沸水浴中溶胀 3小时，这样可大大缩短溶胀时间，而且可以杀死细 菌和霉菌，并可排出凝胶内气泡。 溶胀过程中注意不要过分搅拌， 以防颗粒破碎。待溶胀平衡后用倾泻法除去不易沉下的细小颗粒， 最后凝胶经减压抽气除去 气泡，即可准备装柱。2装柱与平衡装柱前须将凝胶上面过多的溶液倾出， 将层析柱垂直装好。 关闭出口， 向柱 管内加入约 1/3 柱容积的洗脱液， 然后在搅拌下， 将浓浆状的凝胶连续地倾入
8、柱 中，使之自然沉降，待凝胶沉降约2 3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速， 使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约 5cm处时停止装柱，关闭出 水口。装柱要求连续、均匀、无气泡、无“纹路”。将洗脱剂与恒流泵相连，恒流泵出口端与层析柱相连。通过 23倍柱床容 积的洗脱液使柱床平衡， 然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布， 以防将来在 加样时凝胶被冲起，并始终保持凝胶上端有一段液体。3上样与洗脱样品上柱是实验成败的关键之一，若样品稀释或上柱不均，会使区带扩散， 影响层析效果。 上样时应尽量保持床面的稳定。 先打开柱的出口， 待柱中洗脱液 流至距床表面12mni时，关闭出口，用滴管将1m
9、l样品慢慢地加至柱床表面， 应避免将床面凝胶冲起， 打开出口并开始计算流出体积， 当样品渗入床中接近床 表面1mm时关闭出口。按加样操作，用少量（约 1ml）洗脱液冲洗管壁2次。最 后加入少量洗脱液于凝胶上，使高出床表面 35cm,旋紧上口螺丝帽，柱进水 口连通恒流泵，调好流速，以每管 3ml/10min 流速开始洗脱。上样的体积，分析 用量为柱床容积的 12%；制备用量为柱床容积的 20%30%。4收集与鉴定用自动部分收集器收集流出液， 每分钟十五到二十滴左右， 收集三分钟， 紫 外检测仪280nm波长处检测，最高的一个OD值时的体积即为吸收峰的洗脱体积 Ve。5凝胶柱的处理 凝胶用过后，反
10、复用蒸馏水洗后保存，如果有颜色或比较脏，可用 LNaCl 洗涤。短期可保存在水相中， 加入防腐剂或加热灭菌后于低温保存。 建议长期用 干燥状态保存。五、实验结果做出洗脱曲线：具体标准曲线如下：六、注意事项 1. 在装柱过程中是需要注意的有以下要求：【 1】垂直放置 【2】放置产生气泡 【3】放置柱分层。柱上表面要平，平衡柱时间要长一些， 让凝胶充分沉积为均一的柱床。2. 加样时， 【1】加样前打开出口，使展开剂流出，至正好露出凝胶上平面 时，立即关闭出口【2】加样时，用滴管缓缓沿柱内壁旋转加入柱子。【3】打开柱子得出口， 使待分离的样品进入柱子。 加样完成后， 进行洗脱。七 、讨论： 1. 从洗脱曲线上可以看出，出现了四个较明显的峰值(实验结果较为理想)：OD:(Ve=，(Ve=70mD，(Ve=)，(Ve=)，分别对照试验中所 加样的四种蛋白质。由于分子量大的先洗脱出来，小分子量的蛋白后洗脱出来，因此洗脱顺序是蓝色葡聚糖-2000 （200KD，牛血清白蛋白（67KD，胃蛋白酶 （ 36KD）， Cytc （）2. 实验过程中， 可能由于加样时将凝胶柱的上表面破坏了， 导致部分数据不 准确，与预期的效果有点误差。