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1、谷氨酸发酵生产谷氨酸发酵一、实验目的谷氨酸 （glutamic acid） 是最先成功地利用发酵法进行生产的氨基酸。谷氨酸发酵是典型的代谢调控发酵，其代谢途径相对研究得比较清楚。因此，了解谷氨酸发酵机制，掌握其发酵工艺，将有助于对代谢调控发酵的理解，有助于对其他有氧发酵的理解和掌握，也有助于对已掌握的生化、微生物知识的融会贯通。通过本次实验，掌握有氧发酵的一般工艺，熟练掌握通用机械搅拌罐的设备使用。二、实验原理1、谷氨酸发酵机制谷氨酸发酵是菌体异常代谢的产物，菌体正常代谢失调时，才能积累谷氨酸。在正常的微生物代谢中，由葡萄糖生成的磷酸烯醇式丙酮酸比天冬氨酸优先合成谷氨酸。谷氨酸合成过量时，谷氨
2、酸抑制谷氨酸脱氢酶的活力和阻遏柠檬酸合成酶的合成，使代谢转向天冬氨酸的合成。天冬氨酸合成过量后，反馈抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活力，停止草酰乙酸的合成。所以，在正常情况下，谷氨酸并不积累。谷氨酸生产菌由葡萄糖生物合成谷氨酸的途径见图 5-7 。它包括糖酵解途径（EM晦径）、磷酸己糖途径（HM晦径），三竣酸循环（TCA循环）、乙醛酸循环，伍德-沃克曼反应（CO的固定反应等）。2的葡格Y-成曲* 畸熟也需;植就I戌舒*像酸f i 人-国款3晴放-口。2两制赫 乙欷-啊U碇砧酸“阳反一俄遗过群鱼懒谷加威图土丁谷氯酸的生物合成途径由于谷氨酸生产菌生理方面有以下共同特征，体内的代谢控制平衡被打破， 使
3、谷氨酸得以积累。?谷氨酸生产菌大多为生物素缺陷型。谷氨酸发酵时，糖酵解经过EMP及HMPB个途径进行。生物素充足时，HM磁径所占比例是38% 控制生物素亚适量的结果，发酵产酸期， HM曲径所占比例下降到约 为26% EM骑径所占的比例得以提高。通过控制生物素亚适量，更 重要的是由生物素促进的脂肪酸及磷脂合成减少，谷氨酸向膜外漏出， 引起代谢失调，使谷氨酸得以积累。?谷氨酸生产菌的CO固定反应酶系活力强，可通过竣化作用（更多地2供应固定CO生成苹果酸或草酰乙酸转化成柠檬酸。2? 谷氨酸生产菌的异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱，使进入谷氨酸生成期后的乙醛酸循环弱，使异柠檬酸更多地转化成a-酮戊二酸。?
4、谷氨酸产生菌应丧失或仅有微弱的a-酮戊二酸脱氢酶活力，使 a-酮戊二酸不能继续氧化。但谷氨酸脱氢酶活力很强，同时NADPHC化能力2弱，这样就使a-酮戊二酸到琥珀酸的过程受阻，在有过量钱离子存在时，a -酮戊二酸经氧化还原共腕的氨基化反应生成谷氨酸而分泌泄漏于菌体外。? 谷氨酸产生菌不利用菌体外的谷氨酸，谷氨酸最终得到积累。2、谷氨酸发酵工艺三、谷氨酸发酵方法( 一 ) 谷氨酸菌种的制备1、斜面种子的制备(1) 斜面培养基配方 : 葡萄糖 0.1,; 蛋白胨 1,; 牛肉膏 1,; 氯化钠 0.5,;琼脂 2,;pH 7.0 。(2) 接种后于30?恒温培养24 h ，备用。2、一级种子的制备
5、(1) 培养基配方 : 葡萄糖 2.5%;尿素0.5%;硫酸镁0.04%;磷酸氢二钾 0.1%;-6玉米浆2.5%,3.3% (按质增减)；硫酸亚铁、硫酸钮各2X10 g/L;pH 7.0。(2) 用 1000 ml 三角瓶装 300 ml 培养基，封口膜封口， 0.1 MPa 灭菌 30 min ，接种后30?、 120 r/min 培养 12 h 。(3)种子质量标准：A A560(560 nm吸光度净增值) 0.5;pH 6.4?0.1。3、二级种子的制备(1) 培养基配方 : 葡萄糖 2.5%;尿素0.5%;硫酸镁0.04%;磷酸氢二钾 0.16%;-6玉米浆2.5% (按质增减)；硫
6、酸亚铁、硫酸钮各2 X10 g/L(0.0002,);pH 7.0 。（2） 用 1000 ml 三角瓶装 300 ml 培养基，封口膜封口， 0.1 MPa 灭菌 30 min ，接种量为 10,（300 ml 培养基中接入一级菌种 30 ml） ，接种后 30?、 120r/min 培养 7,8 h 。（3）种子质量标准：AA560 0.6;pH 7.2;无杂菌检查阴性（镜检、平板涂布）; 噬菌体检查阴性（斑点试验法 ） 。二级种子培养结束时，无杂菌或89 噬菌体污染，菌体大小均一，呈单个或八字排列。活菌数为 10-10 /ml 。镜检:a、用无菌操作方式取发酵液少许涂布在载玻片上，b、自
7、然风干后用番红或草酸钱结晶紫染色1, 2 min水洗，c、干燥后在油镜下观察。平板涂布检查:a、配制营养琼脂培养基,蛋白陈1,牛肉膏0.3,NaCl0.5,琼脂2,pH7.2,灭菌倒平板，b、取少量待检发酵液经稀释后涂布在营养琼脂平板上适宜条件下培养,c、观察菌落形态。噬菌体检查, 斑点试验法,:a、培养基：葡萄糖0.1,蛋白陈1,牛肉膏1,NaCl 0.5,琼月旨2,pH7.0b、采用混菌法制备好混有发酵菌种的平板再用接种环或无菌吸管取少许发酵液在平板上点种培养后观察是否有噬菌斑出现。（ 二） 谷氨酸发酵1、发酵培养基葡萄糖13,;尿素2,;磷酸二氢钾0.1,;硫酸镁0.06,;硫酸亚铁、-
8、6 硫酸钮各 2 X10 g/（0.0002,）L; 玉米浆 0.6,。2、发酵工艺参数（1）装料系数：0.7（30 L发酵罐装料20 L）。 培养基灭菌：实消。0.1 MPa灭菌30 min。接种：火焰封口法。接种量:10,。（5）发酵过程工艺控制表1发酵过程工艺控制Hj|可 mm温度/ CPH搅拌转速mm 10180327 1 3(20150=600327. 2为06001380347.230013B0 367. 0200? pH控制：酸碱调节。2 mol/ L NaOH 溶液（称取80 g NaOH溶于100 mL蒸储水中）;1 mol/ L HCl 溶液（量取36 mL盐酸溶于64 m
9、L蒸储水中）。?罐压:0.03,0.05 MPa?消泡：（6）发酵过程分析发酵过程中，按以下频次测定、记录以下指标（按表2-1要求及时记录）:pH、风量、还原糖、A、温度1次/小时560谷氨酸含量1次/4 h ,发酵12 h起开始（7）质量检测：每4h检查一次，无杂 菌检查，噬菌体检查。（8）放罐：达到放罐标准后，及时放罐。放罐标准：残糖在1,以下且糖耗缓慢（0.15, / h） 或残糖0.5,（三）谷氨酸提取1、谷氨酸浓度测定1.1 原理L- 氨基酸与茚三酮共热可发生特有的氨基酸显色反应，产物显示其特有的蓝紫色。不同谷氨酸与西三酮反应得到的显色产物的最大吸收波长不同，即 入max不同;加之显
10、色深浅不同，反应出相应氨基酸的不同含量。以此为依据，可为 L- 谷氨酸定性及定量。在pH 5,6 范围内氨基酸的显色反应最灵敏。 1.2 标准样品的制备L-谷氨酸纯品梯度稀释溶液：分别称取0. 05,0. 5 g 分析纯L-谷氨酸，并分别溶解到 100 mL 蒸馏水中，调节pH5. 5,6 。1.3 谷氨酸发酵液预处理谷氨酸发酵液离心， 11 400 r/ min ， 5 min ，取上清液弃去菌体，用蒸馏水稀释 100 倍，调节 pH 5.5,6 。1.4 茚三酮试剂的制备称取0.5 g 西三酮溶于100 mL丙酮中。1.5 pH 调节试剂的制备?2 mol/ L NaOH 溶液 : 称取
11、80 g NaOH 溶于 100 mL 蒸馏水中 ; ?1 mol/ L HCl 溶液：量取36 mL盐酸溶于64 mL蒸储水中。1.6 标准溶液ODfi的测定569取20只试管，分别加入3 mL配制好的0. 5,5. 0 g/ 100 mL 的L-谷氨酸纯品溶液各 2 管。往每只试管中分别沿壁加入 0. 5 mL 的茚三酮试剂，塞上PVC 胶塞。摇匀管内溶液，迅速按先后置于 80 ? 水浴锅中加热3 min 。快速取出保温到时的试管，将之插入冰浴锅中，静置 3 min o将分光光度计波长调至569 nm处，以 蒸储水为空白对照，用1 cm石英比色杯比色，测出各浓度标准样品ODfi。5691.
12、7 发酵样品的谷氨酸含量测定取3 mL预处理好的发酵液加入15 mnrK 150 mm玻璃试管中，调整pH 5. 5左 右。沿试管壁加入0. 5 mL西三酮试剂，塞上PVC胶塞。将试管中液体振匀，迅 速置于80?水浴中加热3 min 。快速取出保温到时的试管，插入冰浴锅中，静置3min。将分光光度计波长调至569 nm处，以100倍稀释的空白液体发酵培养基为 空白对照，用1 cm石英比色杯比色，测出 ODfi。从标准曲线上查出相应 L-569谷氨酸浓度。将从标准曲线上查得的数据乘以稀释倍数即为实际谷氨酸发酵液中 L- 谷氨酸浓度值。2、谷氨酸的等电回收2.1 等电回收流程2.1.1 测定放罐体
13、积、pH、谷氨酸含量和温度。2.1.2 开搅拌，力口 HCl调节pH至pH3.0,3.2 ,搅拌育晶20 h,开大冷水降温，使温度尽可能低。停止搅拌静置沉淀4 h ，关闭冷却水，将上层菌体液放至近谷氨酸层面时，用真空泵将谷氨酸表层菌体和细谷氨酸抽到另一容器里回收。取出底部谷氨酸，离心甩干，水洗谷氨酸，可改善谷氨酸的质量和色泽。 2.2 操作要 点(1)将放罐的发酵液先测定放罐体积、pH谷氨酸含量和温度，开搅拌。若放 罐的发酵液温度高，应先将发酵液冷却到25,30?,消除泡沫后再开始调pH用盐酸调到pH5.0(视发酵液中的谷氨酸含量高低而定)，此时以前及时加酸速度稍快， 影响也不大;(2)当pH
14、达到4.5时，应放慢加酸速度，在此期间应注意观察晶核形成的情况，若观察到有晶核形成，应停止加酸，搅拌育晶 2,4 h 。若发酵不正常，产酸低于4,虽调pH到4.0 ,仍无晶核出现，遇到这种情况，可适当将 pH降至3.5,3.8 左右 ;(3) 搅拌 2 h ，以利于晶核形成，或者适当加一点晶种刺激起晶 ;(4)搅拌育晶2 h后，继续缓慢加酸，耗时4,6 h ,调pH至3.0,3.2 ,停酸复查pH,搅拌2 h后开大冷却水降温，使温度尽可能降低；(5) 到等电点 pH 后，继续搅拌育晶 16 h 以上，停止搅拌静置沉淀4 h ，关闭冷却水，吸去上层菌液，至近谷氨酸层面时，用真空泵将谷氨酸表层菌体和细谷氨酸抽到另一容器里回收。取出底部谷氨酸，离心甩干。发酵液加 HCl育晶 2 h(pH 4,5)加 HCl育晶 2 h(pH 3.8,3.5)加 HCl育晶 2 h(pH3.0,3.2)加HCl(维持pH稳定)搅拌育晶 20 h沉淀 4 h母液 细谷氨酸