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1、香叶醇抗胰腺癌作用及其机制的实验研究第一章香叶醇对人胰腺癌细胞 BXPC-3裸鼠皮下移植瘤的抑制作用目的:观 察香叶醇对BXPC-3人胰腺癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用。方法:建立BXPC-3人胰腺癌移植瘤模型 , 并随机分为空白对照组、香叶醇作用组、吉西他滨作用组 和联合作用组。分别通过腹腔注射相应药物。12d后,剥出瘤块称移植瘤重量,光镜及电镜下 观察移植瘤组织形态学及瘤细胞的超微结构变化。结果:香叶醇可抑制裸鼠XPC-3人胰腺癌移植瘤的生长,香叶醇与吉西他滨 及联合作用组的抑瘤率分别为 5 1 .5%、50.9%及 57.6%。结论:香叶醇能够抑制 BXPC-3细胞移植瘤生长,使其体积变小,
2、重量减轻,对BXPC-3胰腺癌细胞裸鼠皮 下移植瘤增长具有较强的抑制作用;第二章香叶醇对人胰癌细胞株BXPC-3细胞生物学行为的影响目的:为验证香叶醇对胰腺癌的抗肿瘤作用 , 以人胰癌细胞株 BXPC-3为研究对象,观察香叶醇对BXPC-3细胞的生长增殖及凋亡的影响,探讨香 叶醇对胰腺癌细胞BXPC-3体外粘附、迁移、侵袭以及线粒体功能的影响。方法:1MTT法进行香叶醇有效作用浓度筛选,观察香叶醇对BXPC-3细胞增 殖的影响;2倒置显微镜及透射电镜观察 BXPC-3细胞经香叶醇单独或联合吉西 他滨处理后形态变化情况;3流式细胞仪检测BXPC-3细胞的凋亡率,验证香叶醇 诱导BXPC-3细胞凋
3、亡的作用;4原位末端标记TUNEL检测各组细胞凋亡;5JC-1 法检测香叶醇对人胰癌细胞株 BXPC-3线粒体电位变化情况;6细胞基质粘附实 验及划痕实验检测香叶醇对人胰癌细胞株 BXPC-3粘附、迁移、侵袭的影响。结 果:1.不同浓度香叶醇作用不同时间对 BXPC-3细胞细胞增殖的抑制作用结果显示 0.0675mM 0.125mM 0.25mM 0.5mM 1mM香叶醇作用 24h、48h、72h 后,BXPC-3 细胞增殖呈时 - 效和量 -效依赖关系2. 香叶醇作用不同时间的半数抑制浓度IC50为0.38mM以香叶醇作用于BXPC-3细胞48h后IC50的1/2,即0.19mM作为后续实
4、验中香叶醇的工作浓度。3. 香叶醇对BXPC-3细胞生长抑制作用的形态学观察结果显示:对照组细胞 贴壁生长良好;香叶醇处理组见有局部细胞脱落 , 贴壁细胞数量明显减少;吉西 他滨处理组也可见局部细胞脱落 , 贴壁细胞数量减少。联合作用组组:贴壁细胞 数量明显减少。4. 香叶醇对BXPC-3细胞作用的透射电镜超微结构观察显示:对照组 48h BXPC-3细胞分化低,为典型恶性肿瘤细胞的形态特征。 香叶醇组局部细胞出现细 胞连接消失 , 微绒毛消失 , 见凋亡小体。吉西他滨局部细胞见核分裂像和细胞凋亡改变。 联合作用组局部线粒体肿胀 细胞微绒毛消失 , 可见凋亡小体。5. 香叶醇对人肝癌细胞BXP
5、C-3周期作用的流式细胞结果显示:对照组 G1 期细胞比例为42.6%,S期细胞比例24.7%,而G2期细胞比例为32.7%。香叶醇组 细胞周期发生明显的G1期阻抑,G1期细胞比例由42.6%上升为61.5%,而S期细 胞那么由24.7%下降为15.9%; G2期细胞比例那么由32.7%下降到22.6%,细胞周期被 阻滞于G1期;有局部细胞出现凋亡,可见亚二倍体峰。吉西他滨组G1期细胞比例有所增加,占57.6%; S期细胞比例有所减少,为 15.2%,G2期细胞比例亦较少,为27.2%;细胞被阻滞于G1期。香叶醇和吉西他滨 联合处理组细胞出现G1期阻抑比较显著,G1期细胞比例高达64.2%,S
6、期细胞显 著减少,仅为7.1%,G2期细胞比例略有所增加,为29.5%;大多数细胞被阻滞于G0/GI期,而且其G0/GI期阻滞效应比香叶醇或吉西他滨单独处理要强,可见典型 凋亡二倍体峰6. 香叶醇对BXPC-3细胞胰腺癌细胞线粒体膜电位影响的激光共聚焦显微镜 实验结果说明:香叶醇组、吉西他滨组、联合作用组作用BXPC-3细胞48h后,细胞线粒体跨膜电位较对照组显著下降 (P<0.01) ;但三个处理组间相比 , 差异 无统计学意义(P>0.05)。7.香叶醇对BXPC-3细胞粘附能力的影响:香叶醇与 吉西他滨单独或者联合作用BXPC-3细胞,都能减弱其与纤维连接蛋白的粘附作 用,香
7、叶醇、吉西他滨及联合作用组的肿瘤细胞粘附抑制率分别为45.20%1.91%;47.82%2.05%和 73.36%1.10%。8.香叶醇对BXPC-3细胞体外运动能力的影响:香叶醇与吉西他滨单独或者 联合作用BXPC-3细胞能抑制其运动能力,Transwell实验结果说明,空白组、香 叶醇、吉西他滨及联合作用组后的肿瘤细胞数分别为199.218.3,123.4 8.7,131.5 9.2及75.45.5;9.香叶醇对胰腺癌细胞侵袭能力的影响: 侵袭能 力实验结果说明 , 香叶醇和吉西他滨以及两者联合作用胰腺癌细胞均可显著抑制 其侵袭能力 , 与对照组比较均有统计学差异 ,P<0.05 ;
8、结论: 1. 香叶醇能够抑 制胰腺癌细胞BXPC-3的增值,呈时效和量效关系;2.香叶醇能够加强吉西他滨对 胰腺癌细胞BXPC-3抑制增殖与诱导凋亡的作用,并能抑制胰腺癌细胞BXPC-3的 粘附能力、 运动能力及侵袭能力。 其诱导凋亡可能机制之一为降低胰腺癌细胞线 粒体跨膜电位;3.香叶醇能够诱导胰腺癌细胞 BXPC-3凋亡,使胰腺癌细胞BXPC-3 细胞周期发生G0/G1阻滞。第三章香叶醇抗胰腺癌作用机制的研究目的:探讨香叶醇诱导BXPC-3细胞凋亡、细胞周期阻滞和抑制体外侵袭能力的分子机制。 方法: 1.凝胶迁移阻滞实验(EMSA检测核转录因子的活性变化情况;2.蛋白印迹实验检测香叶醇干预
9、对Livin,Survivin,Bcl2,Bax 及 pro-caspase3,8,9 等蛋白变化的影响。3. 蛋白印迹实验检测香叶醇干预对 MMP-2,MMP-9、cyt-c 等蛋白变化的影响。4.RT-PCR法检测移植瘤bcl-2、Bax、Livin 和Survivin 的mRN表达差异。结果:1.香叶醇干预BXPC-3细胞后,NF- k B活性变化情况:与对照比较,香 叶醇干预抑制了 NF-k B活性。2.香叶醇对BXPC-3细胞内Live、Bcl2、Bax及 Pro-caspase3,8,9 表达的影响:蛋白质印迹实验说明 Live 、 Survivin 、 Bc12、 Bax及Pro
10、-caspase3,8,9 在BXPC-3细胞内均有表达,除Bax以外的蛋白香叶醇 干预后表达均下降 ,Bax 表达那么上升。3.香叶醇对BXPC-3细胞胞浆内和线粒体Cyt-c表达的影响:香叶醇干预胰 腺癌细胞后 ,与对照组比较 ,细胞线粒体中细胞色素 (cyt-c) 表达明显降低 ,而胞 浆中那么表达增加;6香叶醇对BXPC-3细胞内MMP-2 MMP-9 TIMP-2、NF-k B表 达的影响:蛋白质印迹实验说明 MMP-2 MMP-9 TIMP-2及NF-k B在BXPC-3细 胞内均有表达,除TIMP-2以外的蛋白香叶醇干预后表达均下降,TIMP-2表达那么上 升。4. RT-PCR
11、检测显示,香叶醇作用后瘤组织中 bcl-2mRNA Livin mRNA及 Survivin mRNA表达减少,Bax mRNA表达增加。结论:1.香叶醇对胰腺癌细胞BXPC-3抑制增殖与诱导凋亡的作用的可能机 制是抑制BXPC-3细胞NF-k B活性及其下游基因Livi n,Survivi n,Bcl2的表达,上调促凋亡基因Bax的表达。2.香叶醇干预能够致使细胞色素 C从胰腺癌细胞线 粒体流入细胞浆激活 caspase, 引起胰腺癌细胞凋亡 , 胰腺癌细胞线粒体结构发 生改变是香叶醇抑制其生长的一个可能的机制; 3. 香叶醇干预还能抑制 MMP2 MMP及 NF- k B的表达,促进TIMP2的表达,抑制胰腺癌细胞的转移与浸润。