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1、水溶液中酶含量的分析测定,1,水溶液中酶含量的分析测定,曾平 03081064,水溶液中酶含量的分析测定,2,为什么要测定酶的含量？,酶的应用十分广泛：作为分析试剂（检测血糖或尿糖浓度，ELISA体系中作为指示剂）；多种有机化合物的实验室和商业合成(如从葡萄糖产生果糖)，生物大分子的降解（如淀粉生成葡萄糖，基因图谱中DNA的特异剪切，低相对分子质量化合物的降解），特定生物大分子的合成（如PCR反应中合成DNA）等。因此，很有必要对酶的含量进行测定。,水溶液中酶含量的分析测定,3,酶含量的主要测定方法,双缩脲法双缩脲法Folin-酚试剂法 Folin-酚试剂法紫外吸收的直接测量法 紫外吸收的直接
2、测量法结束语,水溶液中酶含量的分析测定,4,该方法基于碱性溶液中Cu2 +与蛋白质中两个邻近肽键的专一性反应。因此，不同蛋白质之间氨基酸组成的差异不会显著影响测定结果。,水溶液中酶含量的分析测定,5,1. 配制适当浓度范围的蛋白质标准液（通常为 120mg/mL之间）。2. 取1mL各标准蛋白质溶液分别加在不同的试管中。用1mL蒸馏水或合适的溶液作空白对照。3.取1mL各待测溶液分别加到不同的试管中。4. 取1mL双缩脲试剂（1.5gCuSO45H2O，6.0g酒石酸钾钠溶解于300mL 100 mgmL-1的NaOH中）分别加到所有的标准液、待测液及空白试剂中。5. 试管在37保温15min
3、。6. 520nm波长处用空白试剂调零，测出各种溶液的吸光值。溶液的颜色可保持几小时不变。 双缩脲法的主要缺陷是灵敏度低，因而不适用于蛋白质浓度小于1mg/mL的溶液测定。酶含量的主要测定方法,水溶液中酶含量的分析测定,6,实验实验材料、主要仪器：、Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin试剂）还原，产生深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正比。此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100倍，定量范围为5100g蛋白质。Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中
4、若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。此外，不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。、实验材料、主要仪器：绿豆芽下胚轴（也可用其它材料如面粉）、722型（或721型）分光光度计、4 000r/min的离心机、分析天平、容量瓶（50mL）、量筒、移液管（0.5mL、1mL、5mL）。、试剂(纯度均为分析纯)(1)0. 5mol/L NaOH(2) 试剂甲：,水溶液中酶含量的分析测定,7,(A)称取10g Na2CO3，2g NaOH和0.25g酒石酸钾钠，溶解后用蒸馏水定容至500mL。(B)称取0.5g CuSO45H2O，溶解后用蒸馏水定容至100mL。每次使用前将(A
5、)液50份与(B)液1份，即为试剂甲，其有效期为1d，过期失效。（3）试剂乙：在1.5L容积的磨口回流器中加入100g钨酸钠(Na2WO42H2O)和700mL蒸馏水，再加50mL 85 磷酸和100mL浓盐酸充分混匀，接上回流冷凝管，以小火回流10h。回流结束后，加入150g硫酸锂和50mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15min，驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色(倘若仍呈绿色，再滴加数滴液体溴，继续沸腾15min)。然后稀释至1L，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存，使用前大约加水1倍，使最终浓度相当于1mol/L。,水溶液中酶含量的分析测定,8,实验操作：1标准曲线的制作（1）配制标准牛血清
6、白蛋白溶液：在分析天平上精确称取0.0250g结晶牛血清白蛋白，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解后转入100mL容量瓶中，烧杯内的残液用少量蒸馏水冲洗数次，冲洗液一并倒入容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，则配成250g/mL的牛血清白蛋白溶液。（2）系列标准牛血清白蛋白溶液的配制：取6支普通试管，按表1加入标准浓度的牛血清白蛋白溶液和蒸馏水，配成一系列不同浓度的牛血清白蛋白溶液。然后各加试剂甲5mL，混合后在室温下放置10min，再各加0.5试剂乙，立即混合均匀（这一步速度要快，否则会使显色程度减弱）。30min后，以不含蛋白质的1号试管为对照，用722型分光光度计于650nm波长下测定各试管
7、中溶液的光密度并记录结果。,水溶液中酶含量的分析测定,9,标准曲线的绘制：以牛血清白蛋白含量（g）为横坐标，以光密度为纵坐标绘制标准曲线。,水溶液中酶含量的分析测定,10,样品的提取及测定（1）准确称取绿豆芽下胚轴1g，放入研钵中，加蒸馏水2mL，研磨匀浆。将匀浆转入离心管，并用 6mL蒸馏水分次将研钵中的残渣洗入离心管，离心4 000r/min、20min。将上清液转入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容到刻度，作为待测液备用。（2）取普通试管2支，各加入待测溶液1mL，分别加入试剂甲5mL，混匀后放置10min，再各加试剂乙0.5mL，迅速混匀，室温放置30min，于650nm波长下测定光密度，
8、并记录结果。,水溶液中酶含量的分析测定,11,计算出两重复样品光密度的平均值，从标准曲线中查出相对应的蛋白质含量X（g），再按下列公式计算样品中蛋白质的百分含量。样品中蛋白质含量（）=（ X（g）稀释倍数样品重（g）106 ）*100另外：进行测定时，加Folin试剂要特别小心，因为Folin试剂仅在酸性pH条件下稳定，但此实验的反应只是在pH10的情况下发生，所以当加试剂乙（Folin试剂）时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。酶含量的主要测定方法,水溶液中酶含量的分析测定,12,用于粗略估算的紫外吸收的直接测量法蛋白质对电磁辐射的最大吸
9、收峰在280nm处，这一特性是直接测量紫外吸收法的基础。该方法的主要优点是简便非破坏性。核酸是本方法中最常见的干扰物质，可以通过测定260nm处的吸收值加以校正（260nm处，核酸的吸收值大，而蛋白质的吸收值小）:蛋白质纯溶液的A280/A260值约为1.8，该值会随着核酸含量的增加而减小。也要注意溶液中任何游离的芳香族氨基酸在280nm处都有吸收，使蛋白质含量的测定值偏高。含有少量核酸的蛋白质溶液的最简单的校正步骤如下（要用石英制比色杯）：,水溶液中酶含量的分析测定,13,测定溶液在280nm处的吸收值（A280）:若吸收值大于1，适当稀释后重测。测定260nm处的吸收值（A260）。用关系式：蛋白质（mg/mL）=1.45 A2800.74 A260。酶含量的主要测定方法,水溶液中酶含量的分析测定,14,主要参考文献：.董慧茹等著复杂物质剖析技术.Allan Jones,Rob Reed and Jonathan Weyers著 李玲等译生物学实验技术.Kent K.Stewart Richard E. Ebel著上官棣华等译生物体系中的化学测量4.何锡文等著分析化学1995.23生物体相关物质的分子识别分析,水溶液中酶含量的分析测定,15,THANK YOU！ 谢谢观看,