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1、专题2微生物的培养与应用,课题1微生物的实验室培养,.微生物的类群,微生物,原核类:,真核类,非细胞类：,细菌、支原体、放线菌、蓝藻,个体微小、结构简单,酵母菌、霉菌、食用菌,真菌：,原生生物：,显微藻类、原生生物（如：草履虫、变形虫等）,病毒、类病毒、朊病毒,微生物的共同特点：,一.微生物基础知识,1.细菌的形态,细菌：单细胞不分枝的原核微生物。细菌：微小而透明，常用染料染色后显微镜观察,细胞壁：成分肽聚糖；细胞膜；拟核：无染色体、无核膜、无核仁 质粒：小型环状DNA细胞器：只有核糖体但进行有氧呼吸,细菌的构造,图1-3 细菌的结构,细菌主要是以二分裂的方式进行增殖（如右图）,2.细菌的繁殖
2、,3.细菌的菌落, 定义：,单个或者少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。, 特征：,大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等。可以作为菌种鉴定的重要依据。,几种菌落及其形态,几种菌落及其形态,4.病毒的结构,:由核酸和蛋白质构成。,SARS病毒、 禽流感病毒,朊病毒（蛋白质病毒）,病毒的结构,吸附,注入,合成,释放,组装,5.病毒的繁殖,病毒的增殖一般可分五个阶段，即：吸附注入核酸合成核酸和蛋白质组装释放,6.病毒的营养方式,：寄生,真菌,如图是酵母菌电子显微镜下的形态结构,青霉菌青霉素,链霉素、土霉素、四环素、氯霉素、红霉素等,微生
3、物中发现几千种抗生素，2/3是由放线菌产生的,5 应用:,细菌的营养类型,根据细菌所利用的能源和碳源的不同将细菌分为两大营养类型。自养菌（含光合色素、利用无机物）异养菌（利用有机物）腐生菌寄生菌 大部分病原菌,了解有关培养基的基础知识，进行无菌技术的操作，进行微生物的培养。,一、课题目标：,掌握培养基的制备、高压蒸气灭菌和平板划线法等基本操作技术，熟练、规范地进行无菌操作，成功地培养微生物。,无菌技术的操作。,二、课题重点和难点：,三、技能目标：,知识点一微生物的培养,答案：营养物质生长繁殖水碳源氮源无机盐特殊营养物质氧气,一、基础知识：,（一）培养基,（1）按物理状态来分：培养基可分为固体培
4、养基、液体培养基和半固体培养基。其中固体培养基用于菌种分离、鉴定等。（2）按功能来分，可分为选择培养基和鉴别培养基。（3）按成分来分，可分为天然培养基和合成培养基。,1.培养基的类型和用途,分类和应用,2、培养基配制原则：,（1）目的要明确：根据微生物的种类、培养目的等确定配制培养基的种类，因为不同的微生物对培养物质的需求不同。 （2）营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。 （3）pH要适宜：各种微生物适宜生长的pH范围不同。 细菌pH为：6.5-7.5； 放线菌pH为：7.5-8.5； 真菌pH为：5.0-6.0。,3、培养基的营养构成,不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮源、无机盐
5、等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质,例如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。,4、微生物的五种营养要素,碳源 （carbon source）,氮源（nitrogen source）,生长因子（growth factor）,无机盐（mineral salts）,水（）,提醒微生物最常用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖；最常利用的氮源是铵盐、硝酸盐。对异养微生物来说，含C、H、O、N的有机化合物既是碳源，又是氮源、能源。有些培养基不需要添加特殊营养物质，生物自己能合成，如大肠杆菌能合成某些维生素，
6、作为特殊营养物质。,课堂练习,1.要从多种细菌中分离某种细菌，培养基要用（ ）A.固体培养基B.液体培养基C.加入青霉素的培养基D.加入高浓度食盐的培养基,2.关于配制培养基的叙述，正确的是（ ）A.制作固体培养基必须加入琼脂B.加入青霉素可得到放线菌C.无机氮源也能提供能量D.发酵工程一般用半固体培养基,3.不同的微生物对营养物质的需求各不相同。下列有关一种以CO2为唯一碳源的自养微生物营养的描述中，不正确的 是（ ）A.氮源物质为该微生物提供必要的氮素B.碳源物质也是该微生物的能源物质C.无机盐是该微生物不可缺少的营养物质D.水是该微生物的营养要素之一,4.含CHON的某种大分子化合物可以
7、作为（ ）A.异养微生物的氮源能源B.异养微生物的碳源能源C.自养微生物的碳源氮源能源D.异养微生物的碳源氮源能源,5.自养微生物所需碳源和能源为不同的物质，而异养微生物所需的碳源和能源是（ ）A.CO2 B.NaHCO3C.碳酸盐 D.含碳有机物,.无菌技术,1.无菌技术的概念,防止一切（ ）的侵入，并保持（ ）及（ ）不在被污染的方法。,3.无菌技术的具体操作：（1）对实验操作的（ ）操作者的（ ）和（ ）进行清洁和消毒。（2）将用于微生物培养的（ ）（ ）和（ ）等进行灭菌。（3）为避免周围环境中微生物的污染，实验操作者应在（ ）附近进行。（4）实验操作时应避免已经做灭菌处理的材料用具与
8、（ ）相接触。,2.无菌技术的关键 （ ）。,4.消毒和灭菌,（1）消毒是指使用较为（ ）的物理或化学方法仅杀死物体表面或（ ）的部分对人体有害的微生物，不包括（ ）和（ ）。常用的方法有（ ）消毒法和（ ）消毒法。（2）灭菌是指用（ ）的理化因素杀死物体内外的（ ）的微生物，包括（ ）和（ ）。常见的方法有( )( )( )。,思考讨论加热情况下为何可以杀灭细菌？,煮沸消毒法：100煮沸5-6min。巴氏消毒法：70-75下煮30min或 80下煮15min。化学药剂消毒法：用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒；氯气消毒水源。紫外线消毒。,.消毒的方法：,3.常用的消毒与灭菌的方法,芽孢,有
9、些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.,灼烧灭菌干热灭菌：160-170 下加热1-2h。高压蒸气灭菌：100kPa、121 下维持15-30min.,.灭菌的方法：,2.消毒与灭菌两者的区别,三种常用灭菌方法的比较,1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？,2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。培养
10、细菌用的培养基与培养皿玻棒、试管、烧瓶和吸管实验操作者的双手,答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。,答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。,P1516旁栏思考,练习2:,1.获得纯净培养物的关键是 A 、将用于微生物培养的器皿.接种用具和培养基等器具进行灭菌 B 、接种纯种细菌 C 、适宜环境条件下培养 D 、防止外来杂菌的入侵2.下列操作与无菌技术无关的是 A 、接种前用肥皂洗双手,再用酒精擦拭双手 B 、接种前用火焰烧灼接种针 C 、培养在50左右时搁置斜面 D 、在酒精灯的火焰旁完成3.外科手术器械和罐头食品的处理,要以能够杀死什么为标准 A、 球菌 B 、杆菌 C、
11、螺旋菌 D 、芽孢,D,C,D,课堂练习,1.细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽灭菌，酒精，火焰灼烧等几种不同的处理方法，这些方法可分别用于杀死那些部位的杂菌（ ）A.接种针，手，培养基 B.高压锅，手，接种针C.培养基，手，接种针 D.接种针，培养基，手,2.无菌技术包括以下几个方面的叙述，期中错误的是（ ）A.对实验室操作的空间，操作者的衣着和手进行灭菌B.将用于微生物的培养皿，接种用具和培养基等进行灭菌。C.为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行D.实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触,3.培养基，培养皿，接种环，实验操作者的双手，空气，牛奶所采用
12、的灭菌，消毒方法依次是（ ）化学消毒灼烧灭菌干热灭菌紫外线灭菌高压蒸汽灭菌巴氏消毒法 B. C. D. ,4.高温灭菌的原理是（ ）A.每种微生物的最适温度都是一定的B.微生物对于高温环境不适应C.高温破坏了细胞内的蛋白质，核酸，影响其生命活动D.高温降低了环境中氧的浓度,三、实验操作,1.制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）,二.实验操作(以培养大肠杆菌为例),.制备牛肉膏蛋白胨培养基,1.计算 2.称量 3.溶化4.灭菌: 将50ml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121，灭菌1530min。将培养皿用旧报纸包裹，放
13、入干热灭菌箱内，在160170 下灭菌2h。5.倒平板: 待培养基冷却到50 左右时，在酒精灯附近倒平板。（倒平板操作见课本）,倒平板操作,答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,问题讨论,1.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠
14、，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,.纯化大肠杆菌,平板划线法和稀释涂布平板法。,微生物的接种的常用接种方法有：,1.平板划线的操作方法,平板划线法: 通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面. 在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.,平板划线的操作,一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞
15、无法形成规则的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。,答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,问题讨论,1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答：以免接种环温
16、度太高，杀死菌种。,3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,2.稀释涂布平板的操作方法,微生物的恒温培养,微生物的恒温培养,答：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。,问题讨论,涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？,4.菌种的保存,接种到固体斜面培
17、养基，菌落长成后置于4冰箱保存。,3.微生物的恒温培养,.长期保存：,甘油冷冻管藏法,.临时保藏：,三.结果分析与评价,.培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温12d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。.接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。.是否进行了及时细致的观察与记录培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微
18、的变化。,本课题知识小结:,【典例解析】,例:关于微生物营养物质的叙述中，正确的是( ) A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量 C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量,解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHCO3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaC
19、l则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。,D,例2：下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是( ) A.防止杂菌污染 B.消灭杂菌 C.培养基和发酵设备都必须灭菌 D.灭菌必须在接种前,解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是正确的；B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。,B,