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1、,一纤维支架纤维支架是组织工程研究中最早采用的细胞外基质替代物之一，主要由PGA或其共聚物等结晶性聚合物纤维构成。利用纺织技术将直径1015m的纤维制成织物或无纺物，其孔隙率高达97%，比外表积高达-1，但存在力学强度较差、承压时会坍塌的缺点。,三、支架制备技术,改进：1雾化或喷雾涂曾 采用PLLA或PLGA溶液涂覆织物的方法，可使相邻纤维间形成物理连结，从而使纤维支架稳定、耐压。 2热处理溶出PGA 纤维浸在PLLA/CH2Cl2 溶液中溶剂挥发后PGA 嵌入到PLLA中加热到两种聚合物熔点以上， PLLA 熔点低，先熔化，充满PGA纤维网络所有空洞PLLA防止纤维网塌陷作用。交叉点的PGA
2、 纤维熔融后物理缠结在一起。用氯仿溶出 PLLA通过织物提高机械性能；类似孔结构,纤维网状结构加工示意图A: PGAB: PLLA,(二) 多孔支架,松质骨结构,1. 粒子致孔法最常用的是溶液浇注/粒子浸滤聚合物溶液与均一的盐晶混合溶剂挥发后形成固体的聚合物/盐复合物浸没在水中去除盐可控孔隙率达93%厚度2mm,当盐晶含量为7090时，有均匀的联孔结构,致孔剂粒子可采用氯化钠、酒石酸钠和柠檬酸钠等水溶性无机盐或糖粒子，也可用石蜡粒子或冰粒子。溶液浇铸/粒子浸滤法制备多孔支架时易形成致密的皮层，假设浇铸后不断地振动至大局部溶剂挥发，可防止粒子沉降，抑制外表皮层的形成。非溶剂聚沉 粒子致孔法简单、
3、适用性广，孔隙率和孔尺寸易独立调节，是一个通用的方法，得到了广泛的应用，但致孔时往往需用到有机溶剂。,形成气体的盐致孔水溶性致孔剂致孔冰晶致孔,Guoping Chen,et al. Development of biodegradable porous scaffolds for tissue engineering. Materials Science and Engineering,2001; C 17:639,Morphology of cross-sections of PLLA sponges,2. 热致相别离TIPS,相别离法是指将聚合物溶液、乳液或水凝胶在低温下冷冻，冷冻过程中
4、发生相别离，形成富溶剂相和富聚合物相，然后经冷冻枯燥除去溶剂而形成多孔结构的方法。因而，相别离法又往往称为冷冻枯燥法。 按体系形态的不同可简单地分为乳液冷冻枯燥法、溶液冷冻枯燥法和水凝胶冷冻枯燥法。,均向聚合物溶液：高温低温淬炽热力学状态参数：溶液浓度、冷冻温度、冷冻时间和 冷冻速率等,液液相别离相图,Porous PDLLA/Bioglasss composite scaffolds prepared by TIPS：bimodal and anisotropic pore structures composed of tubular macropores of 100 m, interco
5、nnected with micropores of 1050 m in diameter(冷却到L-S相平衡线以下枯燥),溶液冷冻枯燥,Whang K,et al.A novel method to fabricate bioabsorbable scaffolds .Polymer 1995,36:837-42,乳液冷冻枯燥,Ming-Hua Ho,et al. Preparation of porous scaffolds by using freeze-extraction and freeze-gelation methods. Biomaterials 2004;25:12938,
6、温度低于溶液凝结点,Morphology of the chitosan and alginate scaffolds,水凝胶冷冻枯燥明胶、藻酸盐和壳聚糖等水凝胶,不同温度下，多步相别离粗化，提高孔尺寸、连通性,相别离/冷冻枯燥法孔尺寸往往偏小，但该法防止了高温，因而得到了研究者的重视。,改进：,3. 气体发泡法,1超临界流体技术物理发泡法该法将聚合物压成片,浸泡在高压二氧化碳中直至饱和,甚至超临界状态,然后降至常压,气体的热力学不稳定性导致气泡成核和增长,形成多孔支架。,超临界二氧化碳SCCO2无残留溶剂制备非晶相聚合物支架,优点：不使用有机溶剂，因为残留在支架中的有机溶剂对细胞有害;反响体
7、系可以在比较低的温度下进行3040C,便于药物和生长因子的粘附。缺点：支架的孔隙率和孔径不可控，由气体在固体中溶解/释放过程的形态决定；连通率低1030；闭孔结构，可联合粒子浸滤法改进。,2化学发泡法化学发泡法来制备多孔支架,采用的化学发泡剂主要为碳酸盐类化合物。将聚合物溶液/ 碳酸氢铵粒子混合物参加到模具中,待溶剂局部挥发后直接浸入热水中发泡,最后经冷冻枯燥可得到多孔支架。该法得到的多孔支架孔隙率超过90% ,孔相连性好,孔尺寸约100500m ,并防止了外表皮层的形成。,4. 微球聚集法,将可降解聚合物微球参加模具中,加热至玻璃化温度以上,保持一定时间后冷却、脱模可制得烧结微球支架。 热处
8、理时微球相互接触处由于链运动而连结在一起,冷却至室温后该结构被固定下来,因而得到多孔的烧结微球支架。,Fabrication process of a composite of PLAGA and BG. The composite wasprepared in a 3-D, porous scaffold by microsphere sintering.,PVA,LU et al. J Biomed Mater Res 64A: 465474, 2003,微球紧密堆积产生的孔隙成为支架的孔,孔尺寸范围为37150m ,与微球尺寸成正比,孔隙率那么随微球尺寸增大概有增加,为3139 % ,孔
9、相连性很好。,该法优点在于孔相连性好,孔尺寸易调控,力学强度大,微球可包裹药物、生长因子，进行可控释放。缺点那么在于孔尺寸偏小,孔隙率亦低。,5、静电纺丝,优点：操作简单，制品比外表积大缺点：耗时长、效率低、可控性差，纤维难以排布规那么,6. 3D 印刷浇铸聚合物粉根底如：PLGA按希望的分布点“印微米体积的溶剂液 滴氯仿当溶剂挥发时凝结的粉固化重复以上操作，建立 3D 结构摇出未凝结的粉精确性结构型微孔聚合物或陶瓷支架,Typical morphologies of porous polymer foams produced by solid freeform fabrication tec
10、hnique,快速成型法可一步形成支架的外形和相连的多孔结构,是一种一体化制备方法。优点:成型时间短,利于自动化大规模生产;可根据个体的不同,迅速制备出具有个体特征的三维多孔支架;可制备各个部位具有不同孔结构的支架以适应复合组织的不同要求。缺点：支架孔隙率偏低,通常小于80%. 改进？,7. 相连管状孔道支架将糖纤维等水溶性纤维材料预先构建成具有特定结构的三维“负支架,“负支架经水蒸汽处理后形成连结.将聚合物溶液滴在“负支架上,冷冻使聚合物溶液凝胶化,用水浸出糖纤维冷冻枯燥脱除溶剂,得到的多孔支架具有预先设计的相连管状孔道结构,孔隙率高达90 %以上,并具有纳米纤维孔壁结构。,“负支架的构建既
11、可手工完成,也可用快速成型技术来实现自动化。与通常的快速成型技术不同的是,首先形成的是最终的多孔支架的“负复制品。该支架的相连管状孔道结构更有利于支架内的传质过程,其纳米纤维孔壁结构那么更有利于细胞粘附。,支架设计及制备技术,表：三维支架制备技术,三注射型组织再生支架软支架,可注射型支架是将一种具有流动性的生物相容性良好的材料与异体或自体细胞复合后注射到机体缺损部位, 或直接注人体内, 材料到达缺损部位后能在原位形成具有一定机械强度、形状并且可与体液进行交换的支架。 支架通过注射完成植入, 故可降低手术难度, 减少手术创伤, 特别适用于微创伤的修复。,高长有,马列.医用高分子材料.P229-2
12、34.洪奕等.注射型组织再生支架的研究进展.生物医学工程学杂志,2007;24(2):463-465.,可注射型支架在组织工程中应用的示意图,水凝胶具有在一定条件下可保持流动状态而在外部的物理或化学刺激下可形成一定形状和强度的体型材料的特性, 因此成为可注射型支架的首选材料。,水凝胶作为可注射型支架优点：具有良好生物相容性；水溶液环境有利于保护细胞以及营养物和分泌产物的运输；易用细胞粘附配体进行改性。 水凝胶作为可注射型支架缺点：水凝胶的操作不易控制, 机械强度较低，消毒困难。,1.温敏型水凝胶类可注射支架: 温敏型水凝胶是指当一定浓度的溶液在温度升高或降低到一定值时可迅速形成凝胶, 可分为升
13、温型水凝胶和降温型水凝胶。 由于温敏型水凝胶只需通过改变温度就可凝胶化, 大大降低了外界物质对细胞的影响, 因此用于可注射型支架具有一定的优越性。例如：降温型：琼脂；升温型：PEO、胶原、PNIPAm接枝明胶,2.交联型水凝胶类可注射支架 指在添加助剂或者引发剂后,分子链间发生交联形成水凝胶。交联方式有共价键交联, 离子键交联等。交联也可通过光引发来进行。 如：聚反丁烯二酸丙二醇酯PPF通过主链上的双键和含双键的单体或低聚物进行交联原位形成凝胶。 为减小温度、添加交联剂及引发剂, 对细胞的活性的影响,可采取微囊化复合改进。如，Payne等将骨髓间质成骨干细胞微囊化后种植在水凝胶以保持细胞活性。
14、,3.复合水凝胶型可注射型支架 以水凝胶为载体的可注射型支架主要用于骨修复, 一般是采用微粒与水凝胶材料以适当比例共混,保持流动性, 然后将混合物注射到缺损部位后凝胶化。 目前报道最多的是以羟丙基甲基纤维素水凝胶与具生物活性的磷酸钙(BCP)复合以制备可注射型骨替代物一。 纤维素类水凝胶是一类升温型水凝胶, 可以通过纤维素浓度来控制凝胶化的温度范围。,组织修复中的可注射型材料,PPF：聚反丁烯二酸丙二醇酯,可注射型支架研究中存在的问题:如何提高水凝胶的强度 凝胶化的可控性对于预制备降温型、交联型等水凝胶时与细胞的复合问题等。,MicrospheresBiodegradable PLGA mic
15、rospheres have been studied fordelivery of chondrocytes for cartilage engineering. Non-porousPLGA microspheres could be used as (i) a microcarrier for cellexpansion in vitro 130, prior to use as an (ii) injectable carrierfor cartilage regeneration in vivo 131133. We recentlyreported that highly poro
16、us microspheres (200 m in overalldiameter and 30 m in pore diameter) could be prepared by agas foaming method 29. These porous scaffold microspherescould be used for microcarrier suspension culture of cells, aswell as injection of the cell/microsphere constructs into a tissuedefect site (Fig. 5). Th
17、ese injectable and porous microsphereswould provide a great advantage for cell therapy in manyaspects. Prior to injection, the porous structure (30 m) wouldallow sufficient cell seeding in and out of the matrix. Afterinjection in vivo, the porous matrix would permit infiltration ofcells and in-growt
18、h of tissue from the host, facilitating theregeneration process.,H.J. Chung, T.G. Park / Advanced Drug Delivery Reviews 59 (2007) 249262,Fig. 5. Use of injectable porous scaffold microspheres for cartilage tissue engineering as an example. Primary chondrocytes are seeded within porous scaffold micro
19、spheres, expanded in vitro, and then injected or alternatively implanted as a cultured tissue into a cartilage defect site.,软骨细胞,四天然组织工程支架,天然支架是利用天然材料本身存在的疏松或多孔状结构，通过一定的制备方法得到的多孔支架材料。例如，利用直接或完全替代的原理，用其它个体的骨组织的无机局部作为支架材料。异种骨异体骨脱钙骨、冻干骨海珊瑚,五、组织工程支架的开展,不同材料间的复合生长因子的引入物理结构上的仿生化多层次,理想组织工程支架模式图,生物材料外表改性方法,
20、生物大分子的外表固定化,将具有生物活性的大分子通过物理吸附、包埋或化学键合的方法固定在材料的外表,生物活性大分子：ECM黏附蛋白纤连蛋白、层连蛋白ECM多糖及其类似物透明质酸、壳聚糖细胞黏附多肽RGD细胞活性因子,注： RGD系含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的促进细胞粘附的寡肽,8.4 组织工程中的微胶囊技术,一、 微胶囊概论 微胶囊是指以高分子膜为外壳、其中包有被保护或被密封的物质的微小包囊物。就像鱼肝油丸那样，外面是一个明胶胶囊,里面是液态的鱼肝油。经过这样处理，鱼肝油由液体变成了固体。 微胶囊的颗粒直径要比传统的鱼肝油丸小得多，尺寸范围在零点几微米至几千微米之间，一般为5-200m。,单核
21、,多核,多核，不规那么外形,双璧,微胶囊簇,含微胶囊之微胶囊,微胶囊内被包裹的物质通常称为芯core、核nucleus或填充物fill；外壁称为皮skin、壳shell或保护膜protective film。 微胶囊中所包裹的物质，可以是液体、固体粉末，也可是气体。 由于应用目的和制造工艺不同，微胶囊的大小、形状可有很大变化，其包裹形式也有多种。常见的有:,生物微胶囊的概念 将酶、蛋白质和激素等生物活性物质或微生物、动植物细胞包封在亲水性的选择性透过膜中, 形成的球状微胶囊, 称之为生物微胶囊。,1957年，Chang首次报道生物活性物质的微囊化(Chang T M S. Hemoglobin
22、 corpuscles. Research Report for Honours Physiology. Medical Library, McGill University, 1957)60年代中期, Chang又指出了生物微胶囊在临床及其他生物学应用上的可行性.(Chang T M S. Semipermeable microcapsules. Science, 1964, 146: 524525),通过微胶囊膜的选择透过作用, 使囊外大于某一分子量的物质不能扩散进入, 而生物环境中的营养成分和囊内生物活性物质或细胞分泌的小分子产物可以自由出入微胶囊, 从而到达免疫隔离目的,生物微胶囊示意
23、图,方法：1 把需要的细胞密封在半透膜中2 植入密封装置或与体内连接3 细胞分泌物 治疗4 当治疗完成时装置取出或断开连接,80 年代初,人工胰腺：将微囊化技术与组织细胞移植相结合, 制备了具有良好生物相容性的海藻酸钠/聚赖氨酸微胶囊作为免疫隔离工具, 包埋猪胰岛细胞形成人工细胞, 并移植入糖尿病大鼠体内, 结果说明该人工细胞成功地调节了血糖水平, 代行了大鼠胰腺功能.,Lim F, Sun A M. Science, 1980, 210: 908909,90 年代以来, 医学界开始尝试以微胶囊作为基因重组细胞的免疫隔离和运载工具，利用重组细胞的代谢产物调节机体生理功能, 治疗相关疾病. 目前
24、, 微胶囊的应用研究还涉及药物控制释放、 动植物细胞培养、 细胞和酶的固定化、以及生化物质别离等领域。,二、生物微胶囊的种类及其制备,生物微胶囊在应用上必须满足如下条件：对生物物质没有毒害作用，生物相容性好但不支持细胞粘附，也不刺激细胞过渡生长；良好的传质性质生物活性物质、信息物质、细胞产物和截留隔离性质抗体或免疫细胞；理化性质稳定，并具有一定的机械强度。,两个重要的物理量：微胶囊膜强度 膜强度大小决定了微胶囊在生物环境停留期间能否保持根本完整,从而保证囊内细胞或物质活性。微胶囊膜渗透性 是决定微囊化技术能否用于临床移植治疗或细胞培养的关键.指标：截留分子量,例如： 层-层自组装微胶囊,层层自
25、组装技术Layer-by-Layer Self-Assemble Technique，L-b-L 基于聚电解质阴阳离子之间电荷相互作用的一种超分子组装技术，该技术的驱动力不局限于静电相互作用，也可以是氢键、电荷转移和疏水作用力等，多种作用的协同效应能够大大提高膜的稳定性。,90 年代以来, 医学界开始尝试以微胶囊作为基因重组细胞的免疫隔离和运载工具，利用重组细胞的代谢产物调节机体生理功能, 治疗相关疾病. 目前, 微胶囊的应用研究还涉及药物控制释放、 动植物细胞培养、 细胞和酶的固定化、以及生化物质别离等领域。,层层静电自组装过程示意图,例：PLLA膜片外表胺解以及在在此根底上的静电层层自组装修饰,原料：聚电解质为聚苯乙烯磺酸钠PSS和 壳聚糖,层层自组装技术优点,层-层组装制备聚电解质中空微胶囊示意图,LBL技术制备中空微胶囊：采用可被去除的胶体颗粒作为组装的模板，利用LBL技术将聚电解质沉积到胶体颗粒上，然后将作为模板的胶体颗粒溶解或分解，得到聚合物中空微胶囊。囊壁厚可达几十纳米。,Georgieva等将LBL技术应用于包埋酵母细胞。用层层组装的聚苯乙烯磺酸钠PSS和聚烯丙基盐酸盐PAH作为囊壁，利用荧光技术证实了细胞和囊壁的完整性，发现微囊化的细胞保持原有代谢活性，且仍能分裂。,PAH/PSS微胶囊化酵母细胞示意图红色为PAH, 蓝色为PSS,绿色为标记的PAH,