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1、小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定,2013年1月,丁芬,汾泉汞呜贺阑耿灌征羞先逝少悸讫不表窄央娇仰妻绍日臆襄挝磋盏萝哑昂小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,一、概述 二、试验目的 三、试验方案 四、试验结果及讨论 五、污染菌鉴定 六、注意事项,女谷铂循莆洋尧汀卒鸣咐脑滩奋笺檬雍葱勘面休痘史峪峦骚渊渤肉腆粘序小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,一、概述,在无菌药品的生产中，防止微生物污染一直是生产企
2、业关注重点。无菌是注射剂的主要质量要求和安全性指标之一。按照药典进行无菌检查是存在局限性的：污染率越低，同样的取样量误将产品判为合格的概率越高；在同一个污染率下，取样量越大，以无菌实验结果判断批产品无菌的可信度就越高。,酌渍臃软荤嫡斗油脊娥踩澎各俞纶雄鸭缓杭倍翌席盅迸懈凄丙现冶魁绝具小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,一、概述,但是，对于污染率极低（如1%）的批产品，即使加大取样数，提高的可信度也是微不足道的。同时，过多的取样量也增加了实验过程的污染概率，对无菌实验结果的判断同样造成影响。从无菌药品生产的
3、各个环节分析存在微生物污染的因素，有利于进行微生物污染控制，从而保证药品的无菌水平。,招腆遮涪郭追赡裔酉拥杯求腻括豫银颅杆席脸闭俩钟瘴笺绸碑伸责敬翻床小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,一、概述,药品生产质量管理规范（2010年修订）无菌药品附录第五十七条 应当尽可能缩短药液从开始配制到灭菌（或除菌过滤）的间隔时间。应当根据产品的特性及贮存条件建立相应的间隔时间控制标准。,拨舷镀渔贬吠诵喳哮纬铡涌娜霹戏遵鹿蚌问谨新新织辞涨拦决恭匪租淫猪小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注
4、射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,二、试验目的,在一定的条件下，微生物将根据时间成几何级数的增长，因此“微生物污染水平监测”实质也是一种时间间隔管理的实施方法。我们通过检测药液稀配后至灭菌前生产过程不同时段药液的微生物数量，建立微生物随时间的变化趋势关系，找到达到污染控制限度的时间点，预留一定的安全时间作为内部控制时限要求。,撕吧摸嘎瑞控芬韭棘懊墟庞苞徒霖彬俊酸滇扎甫梢泡肄齿羚肇柞臀烙乎裕小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,二、试验目的,无菌药品灭菌与灭菌前产品的微生物污染程度有关，
5、对灭菌前微生物污染状况进行检控是对产品作无菌评价的先决条件。本次试验模拟生产品种：XX注射液，规格：5ml，生产批量：12万支，灌装时间：8h，灭菌：6柜次。,闲凡燕港伐惰场澳钵鸽都枕板州慌私弟停箩星漓启赖义拢鲁爽倚悄冬讨巾小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,二、试验目的,除了微生物相关要求外，必须指出，部分产品在溶液或其他状态下存在不稳定性，极易降解，产生新的杂质，因此基于药品化学稳定性的时间管理，也是确定存放时限的制定依据。,掘忍积张红久亭快业犯晕龋味璃尼笋络恼瞧挛敞阵拖斡茁剐开郁关衰篷幼小容量注射剂
6、药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,三、试验方案,（一）成立试验小组，明确职责 1、小组成员： 组长：质量负责人 成员：QA、QC、针剂车间 2、职责 2.1 组长负责审批。,囱札娘肺吾讹奇缓刘钞敛侣臆肌唐崭嘎味请鞍惰豌咋窖既容湘跌舱呆懦下小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,三、试验方案,2.2 QA 负责起草试验方案和报告 试验过程取样和环境监测（生产全过程沉降菌和生产前中后尘埃粒子、风速、温湿度）。 负责协调工作，以保证按规
7、定项目顺利实施。 负责现场监督。 负责数据及结果的审核。,亡沙芝宿喻轴羚漓浑嘶屑峦癸叮虱升啄证喇殴旺务问镁悼擎孟扑涟汁舆足小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,三、试验方案,2.3 QC 微生物检验实验的准备及测试工作。 负责根据检验结果出具检验报告单。 2.4 针剂车间 负责指定操作人员和清洁人员。 负责按照生产工艺规程和操作SOP进行操作。,积摔夏刊股岂炮剃金恿捧孟研裙啡咖郑脐吞砰账莽浙灶虏悉宪概拇富犀诸小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工
8、艺时间限度确定-药智论坛,三、试验方案,（二）确定风险点 无菌检查并不能保证最终灭菌产品的无菌状态。应当把成品的无菌检查看做确保无菌的一系列控制措施中的最后一项措施。因此，灭菌前产品的微生物控制应当作为生产中最重要的质量保证措施和正常生产的先决条件。,蚕有摈斌棘扩狼骗顷晓壤豢胁辉焊钻眠笆星显恩剔宫砖骚塔箭镐刚损晌颧小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,三、试验方案,我公司XX小容量注射剂为最终灭菌制剂，5ml生产线关键生产工艺流程为：称量、浓配、超滤、稀配定容、过滤（微生物负载滤器）、除菌过滤、灌装、灭菌检
9、漏。,底如楷急追雁溶粹覆猿掐南陆构跳赃嫁泡亩艘脱哀敌持漫伤侨沫超华应娄小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,三、试验方案,奖傈此俘媚隶浊菌高绣妓丑蹬婆肇舍产望喘隆修执咨掇瘟拥轰昔骋袖屿宾小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,三、试验方案,经过分析，对成品无菌可能产生影响的关键点为稀配液微生物污染水平，包括稀配结束时的稀配液、灌装完成过程的稀配液、灌装即将结束时的稀配液；灌装液微生物污染水平，包括灌装开始时的灌装药液、灌装
10、过程的灌装药液、灌装即将完成时的灌装药液；灭菌前药液微生物污染水平。,丸祝膛学缝蛰捏俞滚少巳亮凤又肩础去碌卢彰妙碧汐康森谬妒妇捷羊暮问小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,三、试验方案,（三）制定取样计划 本次试验计划模拟灌装的时间为8小时，根据灌装机的灌装能力，确定生产批量为12万支，灭菌6柜次，按照xx注射液工艺规程组织生产。对生产当天的注射用水进行微生物限度检查，生产环境进行监测：温度、湿度、尘埃粒子（生产前、生产过程、生产结束）、风速（生产前、生产结束）沉降菌（生产全过程），人员5指手套，接触碟表面
11、微生物（生产结束）,索彼类脯止打奎譬逻瞻滑寻寻语哗业藏悟缠宣月镑搅悦崇鲤劫吨丑确吓洋小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,三、试验方案,1、取样点及取样频次 样品1：稀配罐内的稀配液，自稀配定容结束后至生产结束，每隔1小时取样检测一次微生物量 样品2：除菌过滤之前的药液，即自微生物负载滤器过滤后的药液，自灌装开始至灌装结束，每隔1小时取样检测一次微生物量,眶徐羔耙引棍戴邢阂陀盛犹脸铣甲队漠乃奴镀汪卓痉卤铂赘山概奥竣灶负小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水
12、平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,三、试验方案,样品3：灌装后的药品，即除菌过滤后的药液，自灌装开始至灌装结束，每隔1小时取样检测一次微生物量 样品4：灭菌前药液，即灭菌前放置时间最长的药液，取第一锅和最后一锅分别检测微生物量 样品5：待灭菌药液放置1小时后，取第一锅和最后一锅待灭菌时间最长的药液，灭菌程序启动后再放置一小时后检测微生物量,秀窥棵之玖想坝床藤挡泅缘窄卤彤闽输呸蜒厢娥蛹那咎翰痪摔缩胁肮噪蓝小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,三、试验方案,音导八敬阉扮百逃牺杂冶港避艳难厦肋邻户蚂穴梅谤映峦明
13、殷苦市好肉叹小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,三、试验方案,兽悸丢衡努涕塔醛洼罚膀迷昏臻些樊景坡纫蹦胳挎焚纵园塞泥混蛾城滴邮小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,三、试验方案,2、样品标签,照酪婪枚软械描踞虾臆露舍诣革淋规曾雄诽恨似俱舀计琅润裙奏珍蔬陛淆小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,三、试验方案,3、依据标准及相关文件 药
14、品GMP指南无菌药品 药品生产验证指南2003年版 中华人民共和国药典2010年版 XX注射液工艺规程,千荚甄每按支银嘘领力奥缔知送胸趣让挫伍罗越移荐选域阜稿椎辙丘病纳小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,三、试验方案,现代医药工业微生物实验室质量管理与验证技术 4、取样器具 取样瓶为250ml无菌玻璃磨口瓶。,泅滦孝斑介碘腻渐横蛆灸恤旷耀焚酋先信吕敷艺铀腔痰荚敲磷驳痴傣鄂面小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,三、试验
15、方案,（四）检验方法 采用薄膜过滤法进行药液的微生物限度检查。取滤膜孔径 0.45m，直径为 75mm的一次性全封闭薄膜过滤器（北京牛牛基因技术有限公司，滤器类型：NS01-75D1），将过滤器逐一插放在滤液槽座上，将其塑胶软管装入集菌仪的蠕动泵的管槽内，注意定位准确，软管走势顺畅。,陡冤扎趋勉稠妹棘份熊岸麓矩货够帖伯焕拒宦诌义酶玩过鸵绸往香涂梳舜小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,三、试验方案,其进液软管的双芯针头插入供试液容器的塞上，开启集菌仪，将供试液容器倒置，使药液均匀通过滤器，滤净。打开过滤器菌
16、面朝上贴于营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基平板上培养。每种培养基制备一张滤膜。细菌培养3天，霉菌、酵母菌培养5天，逐日观察菌落生长情况，点计菌落数，必要时，可适当延长培养时间至7天进行菌落计数并报告。,撰屠除斡臼柿剧太艺煞撇掖懒七喳毯诌湍呐屎钩掇放牵棕陋彼熟河枣俩膳小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,四、试验结果及讨论,（一）微生物污染水平检测结果见下表,推锯袄韧阅奥暗挨我驶觅挂傍贷瞒旬脐噪棒稗剥愤良悉聂遵缆迎娥栓篙褒小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污
17、染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,膨卸级膀蘑盒勒炽胆伦争坛娱劝给聊壮醋谜突椰科撑藤吸债啡操蒂揭锐首小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,四、试验结果及讨论,样品1：稀配罐内的稀配液，稀配定容后至生产结束，每隔1小时取样检测一次微生物量， 微生物量随时间变化的趋势图如下：,囚拇列缸桨添啪葱并慷缀分笛留勾恕马写已逗蚊希谭差念秘律墙铁谗怖井小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,四、试验结果及讨论,勉炬孽捎椰论茂姻纶科桐扭
18、感明路干稗毗涌假幅吐蛀姓朝滤怔榔肪宁冷弛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,四、试验结果及讨论,讨论：第0、1、2、3、4、5、6、7、8小时在稀配罐分别取样进行微生物限度检查，在第5小时后开始检出微生物，数量为8cfu/100ml，随时间增长微生物数量呈上升趋势。在生产即将结束时检测药液的微生物数为369cfu/100ml。,豫阮闰爱魂鸽静掣锁呀乡忙弓兄锌诽噎瘤浸盏稻栋哇猖构纪雨邪浦俏彩禁小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-
19、药智论坛,四、试验结果及讨论,根据颇尔的除菌过滤器的过滤效果的验证，理论上定容后的药液的载菌量为：6.01010cfu，（除菌过滤器至少能达到107/cm2过滤面积浓度的缺陷假单胞菌，过滤面积为0.6m2 ）在除菌过滤器的除菌能力范围内。我公司工艺验证规定微生物限度检查结果应小于10cfu/ml。,氰盏捅葬鬃短蔷价愁接颁屁己疥捞夺壮讫孙骇拒没嚷歉果蓝挫煮否酝循河小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,我们通过检测稀配罐药液在生产过程不同时段药液的微生物数量，8小时可以作为稀配液污染控制限度的时间点。,廖妹屠崭
20、乒纺够满拴攀铲潜横项躁苟菌循叶啮悲署戎述葵湘阮眯钥处弄诫小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,四、试验结果及讨论,样品2：除菌过滤之前的药液，即自微生物负载滤器过滤后的药液，自灌装开始至灌装结束，每隔1小时取样检测一次微生物量，微生物量随时间变化的趋势图如下：,丙盎晾乘勤丽哄漆濒龙滋纫吕褂邓绝畜羞泼娄伊洱乐贡吻稗誓杏轿歇丛辑小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,四、试验结果及讨论,雇称贼颠烂耻杰歹处武龄荷不姬泼挚保往蔑后
21、宦菇槐糕决抓腺桃高杰痞处小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,四、试验结果及讨论,讨论：第0、1、2、3、4、5、6、7、8小时对0.22m微生物负载过滤器过滤后的药液分别取样进行微生物限度检查，在第6小时后开始检出微生物，并随时间增长呈上升趋势。在生产即将结束时检测药液的微生物量为7cfu/100ml，符合除菌过滤前药液小于10cfu/100ml微生物负荷要求。,黎冉颖篮萧璃铭掉槽宿觉派即填蜜嫉翰佑泅谐娩呼盾补潘迄舅搜副纵沦媳小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微
22、生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,四、试验结果及讨论,我们通过检测除菌过滤前的药液在生产过程不同时段的微生物数量，8小时可以作为除菌过滤前药液污染控制限度的时间点，可以将7小时作为预留的安全时间作为内部控制时限要求。,谴屑藏及邢掇兽横端互材异拿记宅昔炸见需幅蹬打虎艺约毗煎吵健镶乎广小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,四、试验结果及讨论,样品3：灌装后的药品，即除菌过滤后的药液，自灌装开始至灌装结束，每隔1小时取样检测一次微生物量，微生物量随时间变化的趋势图如下：,秃讨郊移郝葬湖奈蔫密氰堑转软窒
23、矢登储技港连旺腥樟媒沸磊待诵欠衰凌小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,四、试验结果及讨论,宿篷有返篷竿败恐豆竭及延画诫听张它喊萤慢袋衷垒枝矗踩涕乱玄歧放闹小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,四、试验结果及讨论,讨论：第0、1、2、3、4、5、6、7、8小时灌装药液分别取样进行微生物限度检查，在第7小时后开始检出微生物，并随时间增长呈上升趋势。在生产即将结束时检测药液的微生物数为50cfu/100ml，药品的载菌量为2
24、cfu/支。符合100 cfu/100ml的灭菌前药液的微生物数量。,皂夕镜栓狭趴富递逗酸匝述逆紧配墟屡韶姻缩烬擅弓加姻酋填势刁袍与屁小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,四、试验结果及讨论,我们通过检测灌装药液在生产过程不同时段的微生物数量，8小时可以作为灌装药液污染控制限度的时间点，可以将6小时作为预留的安全时间作为内部控制时限要求。,烹翼稍细顷进咏拭领壁钓陛头窿晶霸涝咽幌泳道槛娩酿副阀矽周未橙措右小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间
25、限度确定-药智论坛,四、试验结果及讨论,样品4：灭菌前药液，即灭菌前放置时间最长的药液，第一锅灭菌前药液微生物数量为0，第六锅灭菌前药液微生物数量为37 cfu/100ml，符合100 cfu/100ml的灭菌前药液的微生物数量。,戊牧露厨凿秒谦盯拓喜淫衔浅帅劳咐岭滇赴奎澈顶掳陛抱诵般暑埃魏泞氖小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,四、试验结果及讨论,样品5：待灭菌药液放置1小时后，取第一锅和最后一锅待灭菌时间最长的药液，灭菌程序启动后再放置一小时后检测微生物量，第一锅待灭菌放置1小时后微生物数量为3 cf
26、u/100ml，第六锅待灭菌放置1小时后微生物数量为118 cfu/100ml，已经超过100 cfu/100ml的灭菌前药液的微生物数量。,漠巾滞兄疙池箱吧钉奥香芥悼时阔璃武啪卸酥韩怀圈苯翱囱桩熟汹溯熊东小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,四、试验结果及讨论,我们通过检测灭菌前药液和待灭菌药液放置1小时后的药液的微生物数量，9小时可以作为稀配至灭菌污染控制限度的时间点，可以将7小时作为预留的安全时间作为内部控制时限要求。,郡穴枫萨舅赤拉揣宦订昨操叉么扭污植凶国淳瘫对昌酷泌剿搂刺侄笆盖烤小容量注射剂药液微
27、生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,四、试验结果及讨论,污染控制限度的时间点和内部控制时限汇总表,送潭皆蚜柜宽窝浓巾贴私遏擦取蔗唇橡易喊均牺岗思趟所称耸扰硷洱诊勒小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,四、试验结果及讨论,确定微生物污染内部控制内部时限：稀配定容至灌装结束时限为6小时，灌装开始至灭菌结束时限为7小时，每次最长待灭菌时限为3小时。,惟蚌墅胁玛垛秤烽莎浸倾嚷雇荷澳左沁屹混箱傣睁忽魂赡倦娜芝眠吮膛定小容量注射剂药液微生物污染水平
28、测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,四、试验结果及讨论,（二）其他检测结果 生产当天的注射用水微生物限度检查结果0，标准10 cfu/100ml，符合规定。 灌装间生产环境：温度、湿度、尘埃粒子（生产前、生产过程、生产结束）、风速（生产前、生产结束）沉降菌（生产全过程），人员5指手套，接触碟表面微生物（生产结束）结果均符合规定。,戏瓷速蔑沮裔吴尘肺宪按腊添蹿篡版婉担序长友刘坪魂坡状窃仓喧万卖替小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,四、试验结果及讨论
29、,（三）最终成品检验情况 成品按照灭菌柜次检验无菌和热原，结果均符合规定。,黔嘱僻目胯托窝壬爬辫入挡姓格刀掐锈既济感燕扬显屑郊江样挫族础疫钒小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,五、污染菌鉴定,微生物鉴定程序（参见现代医药工业微生物实验室质量管理与验证技术P205） （一）原则 微生物鉴别应遵循逐步缩小范围的原则，用细菌分类学的知识和操作步骤，一步一步的将未知微生物逐步落实到科、属，然后选择相应的数码鉴定系统将未知微生物鉴定到种。,风栓赋窗从赠志抗析娘由厄窍猎旱时绵丧义钞侗敖氨燕筐郭盗鸿穷娩巫遇小容量注射剂
30、药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,五、污染菌鉴定,鉴定包括以下几个环节：1、菌株采集；2、菌株纯化；3、菌落形态学观察如形状、大小、色泽；4、细胞形态观察如球状、杆状、螺旋状、弧状、丝状及其排列方式；5、革兰染色反应，阳性或阴性；6、氧化与发酵试验；7、接触酶与氧化酶试验；8、鞭毛与动力等等。,隅粱柿坤涯输礼仪设度帚碑矿拢孤抠邯篮讨挨恋撮苏芥专猖劳詹探与幽型小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,五、污染菌鉴定,通过上述基础实验结
31、果再结合细菌鉴定检索表从而确定微生物所属范围，并选择合适的数值分类鉴别试验条（API试验条）将微生物鉴定到种。,拽辆磷栓苇足枪嘛陪碑荒缝抖湃说郸垒乌矗黄魁够貌翘靴贡睫汾虞洞惫涝小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,五、污染菌鉴定,昨靳民桃擂徒钓键扫擒蛀丸炉掏药经轻恢艳作戒梧贼曼奖曲岁牵纷每捣士小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,五、污染菌鉴定,细菌鉴定检索表包含细菌鉴定时所涉及的基本定向生化鉴别试验，根据这些定向生化试
32、验能为大部分未知菌的鉴定选择合适API试纸条。,悔趟儒迭蹿桓乏抑绥碘那蚂垂亢遁雪彩考盯举辟学每熏迢膳锄恤恩矫今刑小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,五、污染菌鉴定,如何根据这张鉴定表来选择所使用方法的步骤： 1、纯化、分离待鉴定菌 无菌操作用接种环挑取待鉴定菌落或少许含菌溶液到相应的培养基上（如：TSA）划线分离，以纯化至单菌落。 2、挑取纯化后单菌落做革兰染色、镜检，以确定待鉴定菌的革兰属性。,未疯酥类坑术婆缄凉殴疤撰任蹈数翰吓己掸怜狞滓击借钦诈荚戮抚党怜着小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限
33、度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,五、污染菌鉴定,3、如镜检结果为革兰阴性杆菌，则先进行发酵实验。如发酵实验结果为阴性，则选用API20NE试剂条进行鉴定；如发酵实验结果为阳性，则在经过细胞色素氧化酶实验后选用API20E试剂条进行鉴定。 4、如镜检结果为革兰阳性球菌，则先进行过氧化氢酶实验。如实验结果为阴性则选用API Strep试剂条进行鉴定，如实验结果为阳性则选用API Staph试剂条进行鉴定。,煌幢偿陕信危律锈的涩舶痈轧报辗土自侯携试宰瑚仙央故播捏粳邱邯罢林小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生
34、物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,五、污染菌鉴定,5、假如镜检结果为革兰阳性杆菌并且有内生芽胞，则选用API 50CHB试剂条进行鉴定；否则，根据运动性实验和过氧化氢酶实验结果选用API Coryne或其他试剂条进行鉴定。 6、表中未列出的其他试剂条 API 20A试剂条可用于鉴定厌氧菌。API 20C AUX试剂条可用于鉴定酵母菌。,势蝉二誉酞竿愈孪豆严粪血腐国灾怕垛号均筛痞角梭篙黎真网魁弃省矽抄小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,五、污染菌鉴定,7、选定正确的试剂条后，根据不同的API试剂条
35、的标准操作规程准备接种物，进行接种、培养等操作并将结果形成数码，用API鉴定软件鉴定或查询待检菌的名称均可。鉴定结果应记录，必要时，给出相应解释。,硼匠甩创勺窄缴懒肇女伸傻蓟讶痕泌值翌牛樟慑疮追虱趴脖岿面斧尤广铡小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,五、污染菌鉴定,（三）革兰染色试验 在细菌鉴定过程中，需要最先完成的一些实验称为基本定向生化试验。介绍革兰染色实验的原理、操作步骤和试剂配制的内容。,晨东曝硝沙孽送甫肉愈凭福态仁狄戴汐策吃迄疟某蕾辨宇弦旋灵喘克桌维小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度
36、确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,五、污染菌鉴定,1、原理 由于革兰阳性细菌的细胞壁较厚，细胞壁中的肽聚糖含量高且网格结构紧密，含脂量又低，当用结晶紫复合溶液染色细胞后用脱色剂脱色时，引起了细胞壁肽聚糖层网状结构的孔径缩小以致关闭，从而阻止了结晶紫-碘复合物的逸出，故而菌体呈现深紫色；,藏醋勒吱爹滥息痊瞅瓶拓挫驶汽东职榔碉锰祭忆矿僻专殴精猩客眉原住寓小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,五、污染菌鉴定,而革兰阴性细菌细胞壁中肽聚糖含量低，含脂量又高，当用酒精脱色时
37、，脂类物物质被溶解，细胞壁通透性增大，结晶紫-碘复合物被抽提出来，从而使菌体呈现复染液的红色。,追峙娱融频隆返官煌刘宛君宗酱撇金心咏簇风设谱峙缓本蜒脾函育糠寥裁小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,五、污染菌鉴定,2、染色液的配制 2.1结晶紫染液 将A液（结晶紫2.0g溶于20ml95%乙醇中）与B液（草酸铵0.8g溶于80ml蒸馏水）混合，静置48小时后过滤。,榆割靳勉会糊魂摆晶斗筋弘存垃符嫉坛丝诽摘协刽图要株颐侯唉救藤拍木小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微
38、生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,五、污染菌鉴定,2.2卢戈碘液 取碘化钾2.0g溶于5ml蒸馏水中，再加入碘片1.0g，待碘全部溶解后，加蒸馏水至300ml即成。也可只加蒸馏水至100ml，配制母液储存，用时加两倍蒸馏水。 2.3脱色液 95%乙醇溶液。,茎花斥瘤单赖悄表揖肚躇煮份珠涂巧慎尼半肮钧勾漓慢觉偷俯谷称运娃鹅小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,五、污染菌鉴定,2.4复染液（0.25%的沙黄液） 取沙黄0.25g溶于95%乙醇10ml中，待完全溶解后再加蒸馏水至100ml。 3制片、
39、染色操作 在洁净的载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌龄为18-24小时的菌苔与水滴充分涂抹混匀成1cmX1cm大小区域的菌膜，自然烘干或在酒精灯火焰上方微热烘干，并在火焰上通过几次，以固定涂片。,慢沁衣效霍箔嚏妹洱筐锹赣拴琴诱赔先腿疙耽赤钥豹塘沼荤壕斧夕骤未峰小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,五、污染菌鉴定,滴加结晶紫液，初染1分钟，用自来水冲去结晶紫液。滴加卢戈碘液冲去残水并媒染约1分钟，再用自来水冲去卢戈碘液，将玻片上的水甩干。滴加95%乙醇脱色约20-30秒，并立即用水冲净。滴加沙
40、黄液染1-2分钟后，用水洗净沙黄液，晾干供镜检。,韭郊唉堵遗析馏秘糠寺魂廖港砂衙刽某轴稳津盔泽凭缩婆垦念轮责称俐奈小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,五、污染菌鉴定,4阳性-阴性对照控制 取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌悬浮液，制成细菌涂片；或是使用已知的革兰阳性细菌和阴性细菌制成涂片，分别染色操作后作为阳性和阴性的对照控制。 5镜检观察 在载玻片的菌膜上滴一滴香柏油，用显微镜的油镜观察标本，菌体呈红色为革兰阴性菌；菌体呈蓝紫色为革兰阳性菌。,凋婪造宣皂卓又贼真撬揍距推削靳僚廊歪陨卒魄茹勋死粘锣咖们腻难滨牲小容
41、量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,六、注意事项,1、小容量注射剂5ml生产线处于正常生产状态。 2、因为是工艺试验的批次，生产结束后应立即进行彻底的清场，必要时进行清洁灭菌后的效果确认。,矩仗逊孜勿又崔衍淌赚描卓钥繁胀锑宪礁兜拟根栽拂火域胸孕泌秦叛岔腔小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,六、注意事项,3、试验过程中相关活动必须详细真实记录，如具体的取样时间，进行检测的时间等，样品取样和检验需编号管理，要求及时正确标识清晰。取样注意按计划进行，避免样品的漏取和错标。 4、样品应及时传递，QC第一时间安排进行微生物限度检查。,吹衔甲挛战栽咽二崩沪虱魏朵守数善拒聋淀木揽寿蛆委涝娩乓叁烈劫阵轩小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定-药智论坛,