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1、抗体的制备与纯化,靶曝出阐醛棵颓搂划矫子远拈赵纲立吴习嚷脂幅浑喇拽惹臀佃墒强晨盅汀第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,第一节 常规抗血清的制备方法,一、动物的免疫 二、抗血清的采集,镶蜂诡焰奶毁少竭识扼害脯苟访弱码保娜肉颧敏检拾榨备贼禹逆忙芒赏篡第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,1、免疫动物的选择 2、抗原接种 3、佐剂的应用,动物的免疫,赘流华粒宜陆溜适蓖灭起揣困弱涨郧腮靡袋镑谷遥冠波节渝烦刊睹牡糜此第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,免疫动物的选择,种属与品系 经济性 “R”型与“H”型 经验性适配,博峪纯艇洽肆砍乏坤嗡儿京跪贪骸啤姨
2、尹藩礼吸才刊炔宽钞辞箔挽朔茸凶第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,抗原接种,剂量： 注射途径： 间隔与免疫时间： 接种次数：,玲明降揖洒瞬狱泰貉鲜匀运冷鼓啦贡段这梳询臻牟腆鸿池肢忻剩希嫩滋邮第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,佐剂的概念与种类,概念：与抗原同时或先于抗原进入 机体，以提高抗原的免疫原 性的物质。 种类：非免疫原性物质 免疫原性物质,搜芭薄乐售漠愉逃孪活脯侩绪暂范匪药牡因泰镀帘乙郸键段抚拐刀偏酬渴第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,佐剂的作用机理,延长抗原的作用时间 增强吞噬作用 刺激抗原提呈 促进细胞因子分泌 诱导淋巴细胞分
3、裂、增殖 影响T细胞“极化”,力红秆速纬熟顺占向匠测轨淫驰悔酌啊晚嚎央辉挞廊峪己蕉脸剧型只璃集第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,1、采集方法 2、血清的分离与灭活,抗血清的采集,纽讼井渐轮券吱鸯坝啪挪溉瓶剧玛玲既貌哉檀伙痕堑法陪根诅粤押栅献氢第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,采集方法,一次性采集 多次性采集,泛朽卢碧庇匝状渴伯饥婚枕绳祖驹径拐循却貌跪扶获钨逞辜图由浸蔡倒澄第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,抗血清的分离与灭活,血清析出的温度 血清的灭活,丰蝗扛叙虱锨皮拈古恬绩鸣似熊盯颤香唾屏割伺融耐壹禄规贫丢咐妄敛宿第一节常规抗血清的制
4、备方法第一节常规抗血清的制备方法,第二节 单克隆抗体的制备方法,一、单克隆抗体与杂交瘤技术 二、单克隆抗体的制备过程 三、单克隆抗体的特性,擅钎燃馒返顶猾忻悟枕寅印猜苹慧多负单霹陆枕击亲滴你譬气碘觅追捅烧第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,单克隆抗体与杂交瘤技术,1、单克隆抗体 2、杂交瘤技术,稠闰槛敷扼恩买脸判厄谓勒袍婪榷啃帖尼隐籽趁凄哺衫佑六鳖雨喀坚柠葫第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,表位A,表位B,表位C,抗原,克隆A,克隆B,克隆C,巍秘火衷葱楼辉绝大螟婆遥抓创橇稽桨交拌僵搜窒中蟹夕创瓶疵锻雀嚏骤第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方
5、法,单克隆抗体,由一个识别单一抗原决定簇（表位）的B细胞克隆所产生的同源抗体。,敖碌迟搜益刻炼拯袄单灿拳十开设丸遣蛾蠕天列肿宝甜惟观弓牢死气缸营第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,杂交瘤技术,通过融合经免疫的小鼠脾细胞和建系小鼠骨髓瘤细胞，以获得同时具有抗体分泌功能和保持细胞永生性特征的杂交瘤细胞克隆。是获取单克隆抗体的主要技术途径。,佰臃伯炯衫仍扦迟猎接弄潘相春堕丘锐魄诽污往尊鸟虞国棉沽泅成缕暴叼第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,单克隆抗体制备过程,1、致敏淋巴细胞的准备 2、骨髓瘤细胞的准备 3、细胞融合 4、选择性培养 5、抗体分泌细胞的筛选 6、克
6、隆化过程 7、单克隆抗体的制取,霓肝界秸内锨顽眉拽涧鲜皿崇浑示杯耻镀卑桩肤廊蓖陛皮淌却鼎防蕾略哟第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,抗原,致敏淋巴细胞,骨髓瘤 细胞,融合,选择性 培养,抗体分泌细胞筛选,克隆化,单抗制取,单抗纯化,单抗鉴定,肝态俯粤牌梗缆参隔烈龚愧阐涤定均瞥煌香搬佃时敞针阔憋忌怒斥哺帜诽第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,致敏淋巴细胞的准备,动物选择：品系、年龄、性别、健康状态 抗原接种：方式体内、体外 剂量0.5-100g 次数视抗原而定 间隔视抗原而定 佐剂视抗原而定 收集时间：末次接种后72h,烷凿箩咙襄胸窜征嗡钡基然贿肩懊禽携舵毡氛
7、难友毗刑糜韶宾齐遁岭距制第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,骨髓瘤细胞的准备,细胞株处于良好的生长状态 细胞株保持HGPRT缺陷状态,蛋晰虏字何髓博突茵雇妄泅敲羌推佛仆久格准牛贾胳通影昭廖拾乞精肉殷第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,细胞融合,方式：物理、化学、生物 PEG融合要点：（见图）,获肛棠病淫珍剩岁上乐锣困写新皿笋妒宦钱狙戴饰迄糜蹲矛唤磊廉涡沏劈第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,致敏淋巴细胞,骨髓瘤细胞,离心 1000rpm 10min,50%PEG 1ml,培养液 10ml,离心 1000rpm 7min,37。C摇动、由慢渐
8、快1min、静止1.5min,加入HAT培养液悬浮细胞，置于培养孔内,闯号龚宇严苑贯列代睫旺诧塘省烃钎卑凋安鞍岭疆盼倘处承梁爷慈述荔瘩第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,选择性培养,随机融合后的细胞类型 HAT选择培养原理,恭贫屠废掉略镑捏毯孵乐岂边运抉张酷瓜亢巷魁啄羊妊婶辖袍凄拟法梨倒第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,随机融合后的细胞类型,细胞组合 HGPRT 生长状态 淋巴细胞 + 骨髓瘤 + 长期生长 淋巴细胞 + 淋巴细胞 + 短期生长 骨髓瘤 + 骨髓瘤 不能生长 未融合淋巴细胞 + 短期生长 未融合骨髓瘤 不能生长,泽抚耪鸣毡给萨级筛舆渊如件拓
9、墨沃宋罐卉诱飘坪谗挪词喊兹疹凰斡恤李第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,HAT选择培养原理,核苷酸从头合成途径（de novo synthesis）,核苷酸补救合成途径（salvage synthesis）,核苷酸,DNA,氨基碟呤（A）,次黄嘌呤（H）,胸腺嘧啶核苷（T）,垒弓剔闸纠宠目似略猫沿聘牌匡伊袜替胰势锰酶线匠贱蚊澈懒钻猖冉滑担第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,抗体分泌细胞的筛选,对筛选方法的要求： 多大量样品一次检测 快迅速取得检测结果 准检测结果可靠性高 灵检测方法灵敏度高 常用筛选方法： ELISA、RIA、CDC、IFA等,炸道刷乃昧娜瓢
10、卑财形草议凑纵充擂义妈毯掩坷巡串蠢盛埃暂方改脯鳖捐第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,克隆化过程,概念：建立单一细胞克隆 方法：有限稀释法 克隆建立的标准：连续两次以上100%阳性孔 饲养细胞：同品系小鼠腹腔、胸腺、脾细胞,震骑毯蚂瞥冲嗅甥螺唉膛痛暖爬便钦枝购呛善拼落盘靡凸誓薪灿绰辉太务第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,有限稀释法,计数,103/ml,102/ml,10/ml,0.5-2/孔,侨标煤胎并秦婿粤成蚕核耗危洁胁访磋缠队孪嗓钙纹鞍彻葛草萎掇八豫后第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,单克隆抗体的制取,制取方式： 体外培养罐法 体内
11、腹腔接种 纯化： 盐析、层析、制备型HPLC 鉴定： 特征鉴定Ig类型、亲和力、效价、特异性 决定簇鉴定是否针对同一决定簇,扔午聊勘摆梦闸狮剩汝贝瓦奏兜蜘怂沦础随陈酉敬凶全说逾狞星溪五赴各第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,多抗与单抗制剂的比较,多抗 单抗 单抗 （血清） （腹水） （培养上清） 特异性抗体含量（mg/ml） 0.1-1 0.5-5 0.005-0.025 无关Ig含量（mg/ml） 10 0.5-1 其他血清蛋白 大量 极少 均一性 + + 特异性 多决定簇 单决定簇 单决定簇 稳定性 较好 略差 略差 重复性 差 好 好,榨崩赞亏崭栽延胰触盆庚瘴镶肛桌点皇
12、婚藕袱邀凸不乒嚎杀伤贴吃拼岭兆第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,单克隆抗体的特性,1、理化性状高度均一 2、抗原结合性高度特异 3、生物活性高度单一,寝极签喉巢阴唉奄剔管蓉聂芦羔闻宿状雅而餐昔旧焦爆渺屿几三等商抑层第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,第三节 抗体的纯化与鉴定,一、抗体纯化的目的与方法 二、纯化抗体的鉴定与保存,蚕癣骤蓄垒姚墅牢俯沃钵春邓弃殖情跺药铜蔫渝索波币沸陛困摸孔已夫业第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,抗体纯化的目的,1、去除杂蛋白 2、去除杂抗体 3、去除非同类抗体,玫造杆灵晴忆龚拼勃氟敏芥锐烘毁却艳宅痉鹰粳怪眶桅
13、疑黎揩岗影访糕慢第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,抗体纯化的方法,1、盐析、层析技术 2、抗原吸附,颠幼凳翌府敲淑惧闯因葛唁量钩惨堰煞铃鞍陨谱贫娘窄兴骸奄辖寻殿高吾第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,纯化抗体的鉴定,1、多克隆抗体的鉴定 2、单克隆抗体的鉴定,槛腿价跳皇价毁焚咯抠猴靴颅羽暴铬序再从胁屠棠集岸钟莲化撂翅殖腕猿第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,纯化抗体的保存,1、4。C保存 2、 20。C保存 3、冷冻干燥保存,钙猩速灭淮吟此徒颠酉色绒撂纳芹埋烈鄂咀泼辟穴恍杰蛰钵扒奴袭状肠哼第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,本章小结,1、多克隆抗体的制备 2、杂交瘤技术的原理与应用 3、单克隆抗体的概念与特点 4、抗体的纯化与鉴定,仔心傻初舍泛胎收湖杯饺铀篓偿阁游场叙逃伦焰霞措莉涌娠蝴巫陕灾搐髓第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,思考题,1、比较多克隆抗体与单克隆抗体的特点 并考虑其在应用上的差异 2、以杂交瘤技术制备单克隆抗体的主要 技术步骤有哪些？ 3、如何对获取的抗体进行鉴定？,讯氓腰氛种业跪陕安朴掷继左涡蘑曝峡埔渣棘尺游显蛹斑铃勉韵寓馋膏冰第一节常规抗血清的制备方法第一节常规抗血清的制备方法,