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1、第五章 目的基因的克隆 周毅峰 2011年春 二 楚 煞 匆 基 查 蹿 仓 柴 充 幻 函 项 篙 狡 倍 吃 盘 凛 前 肛 霞 开 阶 贵 槛 污 须 网 缝 拔 孵 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 目的基因的克隆 D 利用PCR分离目的基因的方法 C cDNA文库法 A 鸟枪法 E 化学合成法 B 基因文库法 驹 事 侣 绅 登 鳞 前 钻 栈 褪 盈 带 赁 慨 饱 预 料 底 涣 过 扫 京 缔 奋 寄 闹 聚 吵 龄 枕 滋 穴 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 基因工程或DNA重组技术
2、三大用途的前提条件是从生物体基因 组中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制 和生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程 菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输 回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。 一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣 的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建 立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另 一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然 后将之克隆表达。 楼 服 广 范 甜 注 造 议 鬼 摇 漆 料 欢 速 居 韦 留
3、 总 屏 维 胁 翘 凿 捕 伯 联 闷 完 氢 耍 柏 野 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 A 鸟枪法 鸟枪法克隆目的基因的基本战 略 鸟枪法操作的改进 鸟枪法克隆目的基因的局 限性 簿 氖 瑰 鄙 皇 胸 笆 铃 明 拿 要 鹤 胖 锈 褒 昼 坤 峰 藕 膏 筐 诽 惕 健 癣 阑 荐 望 兵 脏 粤 谰 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 鸟枪法克隆目的基因的基本战略 随机克隆供体细胞的全基因组DNA 片段，然后通过快速有效的筛选程序从 众多克隆中分离出含有目的基因的目的 重组子，进而获得目的基
4、因。鸟枪法适 用于原核细菌目的基因的克隆分离 生 斥 琴 镰 侧 阂 软 须 潘 斡 诱 份 近 亲 俄 挖 藉 垂 狐 毖 虽 媚 坑 献 桐 册 漆 璃 仙 沮 榜 锥 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 鸟枪法克隆目的基因的基本战略 染色体DNA的切断 超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端 全酶切： 片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开， 大小不可控 部分酶切： 片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整 与载体连接 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载 体；如果转化子采用基因产物功能
5、检测法筛选，则选择表达型载体 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作 为 转化受体细胞 受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达 的受体细胞 筛选含有目的基因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立） 躇 牵 谐 阁 叉 放 待 亲 短 诺 尺 疲 荡 搀 舒 炊 记 奎 丹 莉 罩 辨 嘎 售 船 以 策 睬 空 淤 悼 妇 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 鸟枪法操作的改进 使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。 如果已知目的基因两端的酶切口，可
6、用该酶处理染色体DNA， 然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高 重组子中目的重组子的出现频率 使用特征性限制性内切酶切开染色体 DNA 庭 另 疽 潞 颠 梅 箱 绚 毕 师 滋 享 斡 殿 即 歹 乒 情 驯 绒 疮 衣 凉 呆 嗽 茸 绑 肮 黑 差 寇 狰 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 鸟枪法操作的改进 例如，已知某目的基因位于1.8 kb的SalI 片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼 脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于 1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块，从此 凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进 行拼接
7、 在连接前将DNA片段进行分级 分离 2.0 kb 1.6 kb 1.8 kb 辙 肤 陶 恼 婪 野 察 红 贰 薛 庭 边 护 蔑 热 庙 透 伶 决 也 切 嚎 泄 坐 氛 痢 镑 悯 纫 沁 赤 铡 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 鸟枪法操作的改进 冻融法 滤纸法 吸附法 低融点凝胶法 溶解法 凝胶DNA片段回收技 术 谱 搜 掸 夫 印 诛 仁 鞠 粮 甸 茄 余 嚎 牡 措 和 给 向 琴 哇 捐 挞 圆 身 棺 慨 帽 兢 塔 侯 劈 唯 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 鸟枪法克隆目的
8、基因的局限性 工作量较大，需要了解目的基因的背景 知识 不能获得的最小长度的目的基因 不能除去真核生物目的基因的内含子 结构 臀 柔 尚 燥 难 李 序 围 算 钟 垃 驻 氰 敦 谨 衬 摆 荷 汽 风 收 升 我 割 钩 碉 暗 僳 呢 大 骄 呢 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 B 基因文库的构建 基因文库的基本概念 基因文库的构建程 序 基因组文库重组克隆的 排序 燥 苏 糙 瞪 瑚 拟 泣 吾 幂 客 倡 锰 玩 托 陵 跺 吏 吭 狸 能 腕 暑 船 歌 缎 济 充 徐 径 锌 盂 滋 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五
9、章 目 的 基 因 的 克 隆 基因文库的基本概念 基因库与基因文 库 基因库（gene pool） 特定生物体全基因组的集合（天然存在） 基因文库（gene library or gene bank） 从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式 基因组文库（含有全部基因） 存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为： cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因） 伍 会 堑 汇 电 痛 罗 节 狞 均 码 舍 持 繁 植 维 园 擦 延 而 冠 估 鬃 俱 哟 婿 氦 饼 第 龋 豹 旺 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 基因组
10、 DNA 文库(genomic library) ：指将某生物体的全部基因组 DNA 用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的 DNA 片 段，与合适的载体体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳 性生物群落 cDNA 文库(cDNA library) ：指将某生物基因组转录的部分或全 部mRNA经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组， 贮存于受体生物群体中，这样的生物群体称为cDNA 文库 鬃 技 驱 淆 腥 甜 萍 颂 肝 荤 筐 羊 胆 傅 窄 原 液 脚 鸡 傣 李 瘩 疾 鲤 援 性 玄 钳 紊 堆 现 侧 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基
11、 因 的 克 隆 根据构建文库所用的载体不同可将基因文库分为 质粒文库 噬菌体文库 黏粒文库 人工染色体文库 M13 phage vector、 phage vector 、 P1 phage vector et. Cosmid vector YAC、BAC、PAC、TAC 呢 谆 纸 栋 灸 秸 妄 弃 拭 浑 悸 简 瞬 润 淤 雕 紊 戒 脯 于 宗 肥 盛 狸 哟 仪 汗 桨 猾 乳 嘶 洪 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 基因文库的基本概念 基因文库构建的基本战 略 用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNA 用cDNA法构建cDNA
12、文库，材料来自mRNA 在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA 种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库 一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA 文库等。很显然， cDNA文库的信息量远小于基因组文库 雇 辖 娠 鸵 冕 朽 敷 膏 物 邹 弯 切 潮 联 墨 糟 科 烦 釜 单 吕 宰 锣 啄 憎 梆 恢 毖 踊 固 枯 懊 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 基因文库的基本概念 基因文库的完备 性 基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概 率，它与基因文库最低所含克隆数
13、N之间的关系可用下式表示： N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f ) 其中： P = 任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率 f = 克隆片段的平均大小 / 生物基因组的大小 例如，人的单倍体DNA总长为2.9 x 109 bp，基因文库中克隆片段 的平均大小为15 kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要 45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180 万个克隆 为 婚 塔 逻 贴 蛊 晓 睬 筏 焚 揣 理 距 践 余 薯 荚 辛 看 亡 吕 盗 杰 挑 诡 毫 虑 衡 颂 馈 搜 希 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目
14、的 基 因 的 克 隆 基因文库的基本概念 基因文库的质量标 准除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件： 重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力 载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序 克隆片段易于从载体分子上完整卸下 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选 磺 掣 枫 褒 蓟 店 驭 洛 稚 苔 谰 诀 滑 束 绣 根 努 缠 仆 桃 谢 北 何 诬 纵 惫 绣 塞 卑 枝 暴 坟 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 基因文库的构建程序 基因组DNA的制 备 为了最
15、大限度地保证基因在克隆过程中的完整性， 用于基因组 文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的 DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段 的比率就越低，重组率和完备性也就越高 AA AA 用常规方法制备的染色体 DNA的长度一般在100 kb左右 如果先将细胞固定在低融点凝 胶中，然后置入含有SDS、蛋 白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1000 kb大小的DNA片段 膊 轨 仔 肺 滩 宫 徊 身 剑 窄 他 殿 锚 悠 妮 缅 词 川 狐 伤 弥 袍 孟 笋 漠 挞 顶 元 睬 减 申 支 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目
16、 的 基 因 的 克 隆 基因文库的构建程序 基因组DNA的切 割 用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和 限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是： 第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区 第二，保证DNA片段大小均一 超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头 部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如： Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控 连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级 分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！ 桃 梆 持 颇 课 色 裂 浸 溃 用 仗 匹 泞 别 舒 袖 翘 扎 灭 嚣 抢 揉 漓 视
17、 步 蜜 迂 蹈 贮 姬 配 踢 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 基因文库的构建程序 载体和受体的选 择 出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的 l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体 l-DNA 由于绝大多数真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文库构建的载体 通常选质粒 上述几种载体的最大装载量如下： 质粒 考斯质粒 15 kb 25 kb 45 kb BAC300 kb YAC400 kb 用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌 述 柠 桥 闹 葫
18、 腺 氧 慑 轿 蚊 翰 小 洁 靶 陪 莉 塞 孜 汇 蔗 霄 菌 幸 昆 截 挺 樟 老 承 慎 竣 庇 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 基因文库的构建程序 从基因文库中筛选目的 基因 大型基因组文库一般由数十万甚至上百万个重组克隆组成。除 了一些具有特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因、结合蛋白 编码基因等）可以采用特殊的正选择筛选程序（如抗药性筛选法、 酵母双杂交技术等）直接筛选外，一般的基因组文库筛选均需多轮 操作步骤 坯 罪 袁 淋 农 橇 序 缝 蝴 儿 卓 曰 菩 狸 尝 奸 绎 吏 叛 档 丢 鸟 桅 硕 硷 嗜 血 瞥 走
19、狡 剔 叛 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 酵母双杂交体系（Yeast Two-hybrid system ） 真核生物的转录因子大多是由两个结 构上分开、功能上独立的结构域组成 的。如GAL4的N端1-147aa是DNA结 合域（BD），其C端768-881aa是转录 激活域（AD）。一般情况下，AD能 与GAL4效应基因启动子上游的特定 DNA区段（UAS）相结合，而此时， AD则推动了转录起始。 响 慢 陆 虹 喧 象 薛 南 巡 酶 爵 贞 坏 羽 锋 男 掐 雏 氢 巍 酋 若 监 绝 佛 蒲 方 遏 裔 谭 狼 屁 第 五 章 目 的
20、 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 d. 从大肠杆菌中分别提取这两种重组质粒DNA，共转化感受态酿 酒酵母菌株。 e. 将共转化的酵母菌株涂布于缺少Leu，Trp和His的培养基上，筛 选表达相互作用的杂种蛋白的阳性菌落。 主要实验过程 a. 选择缺失GAL4编码基因的酵母寄主菌株-SFY526或HF7c； b. 构建带有GAL1 UAS-启动子-lac Z（His3）的转化载体; c. 把已知的靶蛋白质编码基因克隆到pGBT9的多克隆位点上， 把所有cDNA都克隆到pGAD424载体上，构成cDNA表达文库。 禄 斤 籽 迎 劳 侍 互 沦 尹 闪 洱 礁 殉 初
21、仔 潜 揭 粒 揭 州 帐 斥 赦 穷 釜 渴 蔚 酝 吱 瓣 漫 掉 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 游 撮 仁 嚎 啊 厘 榆 犬 裙 唆 弹 阔 鳃 彻 疟 氟 淮 携 祁 戈 薛 犁 斜 强 民 烦 脊 湾 病 哆 尽 橡 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 兴 拎 兴 崎 掺 暴 瓦 皇 剧 线 坐 嗓 漏 持 嗽 鲤 鹤 彰 亡 模 黄 等 皋 着 蹄 悔 腑 扬 衅 镐 俊 囱 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 虏 询 网 怂 圭 抠 掖 许
22、尺 饮 鬼 森 桐 爬 屉 驶 慧 郑 酗 岁 帮 客 透 鬃 桥 茹 淡 恨 柒 凛 柯 褪 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 基因文库的构建程序 从基因文库中筛选目的 基因 密集铺板（1-10万） 杂 交 挖 取 铺 板 铺 板 目的重组克隆 椽 欢 闺 赘 拽 智 怜 客 带 尉 幅 蛋 窘 卢 坤 哭 厨 据 昼 倦 柯 艇 否 盖 贱 盘 壬 喊 汁 御 简 淫 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 基因文库的构建程序 基因文库构建的技术性 问题 在基因组文库的构建过程中，最应引起重视的问题是：
23、严禁外源DNA片段之间的连接！ 为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合： 将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离 用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基 团 用TdT酶在DNA片段的末端上增补同聚尾末端 私 夹 湘 穆 汽 皂 甫 淄 肠 兴 镍 边 蚀 隧 疑 掠 藐 眶 陪 茸 涟 暂 乃 睁 杜 液 睬 凌 罐 沿 层 矛 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 基因组文库重组克隆的排序 大型基因文库（包括人的基因文库）的构建在技术上并不 十分困难，如果一个YAC基因文库的插入片段总和为整个基因 组的十倍以上时，一般就能从基因文库中
24、调出任何一段DNA序 列。然而基因文库的克隆都是随机序列，必须将所有的克隆排 列成一个像天然染色体DNA上所表现出的信息顺序。这项工作 的工作量可能远大于基因组文库的构建，属于基因文库的后期 制作 媚 忌 施 帜 炼 傲 捌 刀 鸿 饰 谴 茅 杰 婶 樱 腻 岁 董 笛 恭 镣 杨 咯 宛 内 郊 薄 呕 远 长 搂 们 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 基因组文库重组克隆的排序 将单一的YAC克隆插入DNA片段用限制性内切酶分布均匀 地水解成若干片段，末端标记同位素 然后再用Sau3AI或MboI将末端标记的DNA片段降解成碎 片，聚丙烯酰胺凝
25、胶电泳，每10个YAC克隆走在同一块板上， 形成10个克隆的特征性DNA指纹图谱 电脑分析指纹图谱，如发现任何两个克隆DNA的指纹图谱 有部分相同的，则其两个YAC片段就有互相重叠的可能性，于 是这两个YAC克隆的DNA片段克隆在染色体上是排列一起的 酶切片段末端标记 法 袒 史 耿 崇 咆 勃 巨 斯 与 亢 痰 诉 贵 辊 莱 嚷 秩 传 老 认 淖 嗡 质 愿 棚 颠 硕 涛 叁 懊 铣 嚼 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 酶切片段末端标记 法HHHH S S SS SSSSS SSSSS S S SSS 单一克隆指纹图谱 十克隆指纹图谱
26、载体DNA克隆DNA 邹 碟 抛 亚 肤 维 露 屉 贮 截 产 淑 誊 娜 枚 探 菏 煤 见 厅 租 蚂 伦 泵 坏 理 义 唬 芭 刽 睬 怔 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 基因组文库重组克隆的排序 将若干YAC克隆固定在薄膜上，并复制二十份薄膜；合成 20种不同序列的短探针，其序列是随机的 用20种探针随机定位杂交（一对一）20份YAC克隆薄膜 如果某两个克隆同时对同一种探针呈现杂交阳性反应，则 这两个克隆有可能是相互重叠的。若将杂交阳性结果记为“1” ，而阴性结果记为“0”，可清晰地列成一张表，最终排出上述 YAC克隆的排列顺序 随机
27、探针联合杂交 法 匪 尧 问 摸 鼓 蔷 民 划 拳 倒 阳 卵 端 棍 惋 宰 醒 取 蹋 瑞 颓 仆 蝶 虐 敞 圾 贿 导 奥 呀 氛 喝 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 01020304050607080910 11121314151617181920 A B C D E F G 0102030405060708091011121314151617181920 D A B C E F G 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 垄 柠 够 磷 幕 湃 箭 砍 渊
28、艳 劈 集 靠 奥 犊 杀 诞 艾 轮 枕 摄 俐 典 症 洲 楷 唾 酉 塘 泅 酣 莱 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 0104120613140214071911150508160310092018 D A B C E F G 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 F C A D G E B 陕 罕 赘 土 怠 帮 凭 班 君 垦 找 猎 盒 阔 祝 胖 淮 鹃 岭 便 预 揍 扦 耘 仅 偶 唆 韩 藻 蕴 眼 精 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五
29、 章 目 的 基 因 的 克 隆 基因组文库重组克隆的排序 从基因文库中任取一个克隆作为染色体走读的起点，将之 两端序列分别亚克隆，亚克隆片段在0.5 - 2.0 kb范围内 分别以上述亚克隆DNA片段为探针，杂交同一基因文库， 杂交阳性克隆中的插入DNA片段必定与起点克隆所含的DNA片 段连锁在一起 然后再以阳性克隆片段的两端序列为探针，进行第二步走 读，直至线型染色体DNA的端点 染色体走读法（chromosome walking） 率 琶 指 刚 蔗 弱 配 斩 牵 熄 霉 忧 辗 忆 幼 壹 蓑 喊 恼 括 塔 健 幻 瞥 相 禹 押 纱 片 厘 啃 事 第 五 章 目 的 基 因 的
30、 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 染色体走读法（chromosome walking） 走读的起点克隆片段 亚克隆旁测序列探针标记 第一轮杂交 阳性克隆阳性克隆 第二轮杂交第二轮杂交 薪 羔 陵 蹋 茹 肯 则 粗 兽 盏 胎 氯 功 饶 碘 瞬 箭 俘 遏 牺 逐 腑 赢 会 榜 叉 扑 书 殃 屡 防 遇 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 染色体走读法（chromosome walking） 走读的起点克隆片段 贝 恩 谁 篱 赠 厚 牙 浓 析 炕 生 审 角 的 撩 汹 旨 脆 茁 膀 良 掩 讽 昭 耗 裙 众 花 羌 呛
31、 祝 皆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 cDNA 文库的DNA 片段是互补 DNA (complementary DNA , cDNA) cDNA 是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的 mRNA 经体外反转录后形成的双链 cDNA cDNA 文库代表生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水 平上的基因的群体，并不能包括该生物的全部基因，且这些基因在 表达丰度上存在很大差异。 C cDNA法 闷 法 叭 咆 辫 享 校 详 络 休 怕 遂 砾 蹲 郎 鞍 汉 孺 芦 撒 吟 咆 押 壳 寨 径 什 怒 膛 失 胡 顿 第 五 章 目
32、的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 细胞总 RNA 的提 取和 mRNA 分离 第一链 cDNA 合成 第二链 cDNA 合成 双链 cDNA 克隆进 质粒或噬菌体载体 并导入宿主中繁殖 cDNA 文库的构建共分四步 诬 埔 隶 剂 调 馅 些 篆 歧 珊 碴 魔 吞 抱 劣 甚 网 殉 舔 尊 选 虫 盔 稼 酪 难 荐 劈 迪 宣 案 再 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 Step 细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离 cDNA 文库构建是以 mRNA 为起始材料的， mRNA 在总 RNA 中所占比例很小，因此
33、从总 RNA 中富集 mRNA 是构建 cDNA 文库和其它应用所必需进行的步骤。通过降低 rRNA 和 tRNA 含量，可大大提高筛选到目标基因的可能性。 目前纯化 mRNA 的方法都是在固体支持物表面共价结合固定 一段由脱氧胸腺嘧啶核苷组成的寡聚核苷酸 oligo（dT）链， 由它与 mRNA 的 Poly（A）尾巴杂交，从而吸附固定住 mRNA ，进而将 mRNA 从其它组分中分离出来的。 霍 音 宏 玲 舞 力 髓 遂 等 树 艾 丘 框 捕 并 又 次 滦 彩 聚 愁 卧 峦 幻 小 胸 驱 钳 唬 门 檀 社 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的
34、克 隆 指导合成高分子量蛋白质的能力，指导合成目的多肽 的能力， mRNA 的大小，总 mRNA 制剂指导合成 cDNA 第一链长分子的能力 mRNA 的完整性 高丰度 mRNA ：珠蛋白，免疫球蛋白，卵清蛋白，在特 定细胞中占 50-90% 。 低丰度 mRNA ：含量0.5% 被称为低丰度或稀有 mRNA mRNA 的丰度 域 值 话 豌 菠 胁 兢 盔 氢 捆 芳 撰 泳 袱 拯 贼 服 寿 摩 草 含 耪 镀 细 烧 息 献 曝 语 箭 肘 惟 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 跌 茁 娟 酪 设 惜 吻 窒 披 颗 肤 驰 哩 提 桐 酥
35、 臼 炼 狼 域 逗 郡 舷 盐 翌 漫 济 愿 衙 占 插 嫌 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 cDNA法克隆目的基因的基本战略 mDNA 5ppp5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3 5ppp5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3 TTTTTTTTTTTTTTp 5 5ppp5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3 TTTTTTTTTTTTTTp 5 cDNA第一链 引物退火 逆转录酶dNTPs 合成 DNA 时需要引物引导，目前常用的引物主要有两种，即 Oligo（dT）和随机引物。 Oligo（dT）引物一般
36、包含 1020 个脱氧胸腺嘧啶核苷和一段带有稀有酶切位点的引物共同组成 ，随机引物一般是包含 610 个碱基的寡核苷酸短片段。 Step First cDNA strand synthesize 隶 谐 强 匿 哦 茵 谩 沪 帕 井 胃 娟 辙 拯 壹 缆 播 配 蹋 滚 松 缄 绢 敌 讥 近 置 胁 摔 葫 恳 曳 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 煮沸NaOH 自身引导法：获得的双链cDNA 5端会有几对碱基缺失 AAAAAAAAAAAAAA 5ppp5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3 TTTTTTTTTTTTTTp 5 TT
37、TTTTTTTTTTTTp 5 TTTTTTTTTTTTTTp 5 AAAAAAAAAAAAAAOH 3 TTTTTTTTTTTTTT OH 3 KlenowdNTPs S1 Step Second strand synthesize of cDNA 行 仙 轮 狙 邓 吕 兆 莲 纳 薯 质 库 姑 边 位 寞 千 嘴 便 辨 祟 已 晕 供 券 咙 谣 宦 椽 珐 裴 勿 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 cDNA第二链的合 成 DNApol dNTPsRNaesH 置换合成法：获得的双链cDNA 5端也会有几对碱基缺失 5ppp5 G G A
38、AAAAAAAAAAAAAOH 3 TTTTTTTTTTTTTTp 5 AAAAAAAAAAAAAAp 5 5 S1 AAAATTTOH 3 TTTTTTTTTTTTTTp 5 5 TTTTTTTTTTTTTTOH 3 AAAAAAAAAAAAAA 5 5 TTTTTTTTTTTTTT 3 3 T4-DNA ligase 战 误 茸 踌 盔 船 求 乡 爹 糙 矣 灰 羡 网 柠 涪 病 期 塘 茫 槽 区 寨 畏 际 肿 僧 着 岸 除 询 磺 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 cDNA第二链的合 成 dCTPTdT 引导合成法：获得的双链cDN
39、A 能保留完整的5端序列 5ppp5 G G AAAAAOH 3 TTTTTp 53 HO 5ppp5 G G AAAAACCCCCCCOH 3 3 HOCCCCCCCTTTTTp 5 3 HOCCCCCCCTTTTTp 5 3 HOCCCCCCCTTTTTp 5 5 pGGGGGGG 3 HOCCCCCCCTTTTTp 5 5 pGGGGGGGAAAAAOH 3 NaOH 退火 KlenowdNTPs 酞 沧 急 标 垄 哦 彰 溶 严 颧 败 盔 鞍 任 盒 扶 讲 割 床 债 腊 蹿 情 螺 商 德 哦 括 同 骗 窃 批 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基
40、因 的 克 隆 Step dscDNA cloning and transformation 双链平头的cDNA通常可用下列三种方法克隆入载体中： 平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收 平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组 分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段 加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收 将重组子转到受体中，扩增、检测阳性克隆 捕 叹 租 倡 骋 滚 忙 样 苟 婿 赦 湖 疟 郡 仑 先 民 终 弦 卯 屠 躁 叠 侮 拧 别 泽 幽 帚 戊 渐 晌 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 cDNA法
41、分离目的基因的基本程序 特异分离程 序 提取细胞总mRNA，琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标 mRNA，由此合成双链cDNA，然后进行克隆 特异分离程序较适用于mRNA丰度极高的目的基因克隆如 血红蛋白基因等 衍 予 甸 胚 铺 署 蔫 椒 铁 译 撅 惊 檄 除 入 岂 砂 宵 鱼 鸟 胀 熄 圃 汽 侠 鳞 随 恰 宏 住 试 查 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 cDNA法分离目的基因的基本程序 差异分离程 序 利用两组细胞mRNA种类的差异，分离克隆差异mRNA所对 应的cDNA，因而这种程序较适用于分离克隆新基因 例如：正常的大鼠FR3T3成
42、纤维细胞中，有些新基因是不能 自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克 隆这些新基因，进而研究其生物学功能 噪 噶 琢 峻 漫 音 被 哦 骗 坊 均 鄂 情 泰 拖 纺 愧 逢 蕉 灼 质 躲 逾 铸 虹 劣 鹃 利 删 蔚 屎 蝴 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 差异分离程 序 多瘤病毒感染的FR3T3细胞 正常的FR3T3细胞 总mRNA 总mRNA cDNA 双链cDNA 单链cDNA 提取mRNA 合成cDNA 合成第二链 克隆 提取mRNA 共价交联 上柱 原位杂交 病毒诱导表达的基因 cDNA克隆 形 拢 崇 永 堕
43、 鉴 咸 绑 秀 妖 草 陛 鹊 叮 妈 吴 洞 悠 给 有 要 孔 峦 钒 霍 历 粱 园 骂 荔 球 悠 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 筛选目的基因片段的差别杂交及减法杂交技术 差别杂交（differential hybridization） 差别杂交：又称为差别筛选（ differential screening），特别 适用于分离特定组织中或发育 阶段表达的基因以及受生长因 子调节的基因，也可用于分离 经特殊处理诱导表达基因 晚 淋 春 朵 瓦 督 衔 矣 邻 耐 迄 馁 肿 千 吾 锈 松 本 片 斯 芽 锤 藤 任 讯 垮 疟 针
44、碱 搜 拴 证 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 椅 攘 琳 准 辗 啥 迅 悦 撰 挂 姬 笛 母 版 怜 氰 鲸 康 赘 被 骇 辖 赔 枝 跃 耪 宜 碗 僵 巡 欧 议 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 差别杂交的局限性 灵敏度低，特别是对低丰度的mRNA。 工作大，耗时耗钱。需要筛选大量的杂交滤膜， 鉴定大量的噬菌斑或克隆片段。 重复性差 黍 隅 裔 句 躇 悍 吼 朱 机 鞋 龋 怎 截 吁 礼 廷 涪 舌 写 贩 疹 闽 废 奈 搐 淤 梨 盾 铸 篮 贤 嫉 第 五 章 目 的 基 因
45、的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 减法杂交（subtractive hybridization） 减法杂交：又叫差减杂交、扣除杂交、减数杂交或消减杂交，是 通过DNA复性动力学原理富集目的基因序列，并以此构建减数 文库（subtractive library）的方式来进行目的基因分离克隆的。 减法杂交的对象 Genomic DNA cDNA Genomic DNA subtractive hybridization mRNA subtractive hybridization 克隆两样品存在特异性的基因 克隆两样品差异表达的基因 父 备 芳 拽 巫 冯 毗 恬 财 夏 之 翘
46、 尧 田 绪 镣 墓 索 潞 活 差 扬 泼 滁 涸 概 索 骇 手 坎 钳 猴 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 减法杂交的本质是除去那些普遍共同存在的或非诱发产生cDNA序列 ，从而使欲分离的目的基因的序列得到有效的富集 Differential cDNA between T and B cell, content 2% in T cell, total positive cloning: 35 , which purpose gene (T-cell receptor) is contained 典 夯 混 漓 贷 江 艰 韵 早 枪 苔 腺
47、 棕 后 营 辊 啤 甜 稠 侍 灯 轰 乾 熙 术 侯 脾 川 脏 贿 乓 闸 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 减法杂交也可用于分离缺失突变基因 躺 墙 钵 廓 超 淳 熄 绑 颐 庚 讶 接 盂 匀 拧 折 鹿 庄 磐 奄 冒 嗡 屿 拣 是 邪 贱 方 偿 朗 二 僻 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 减法杂交的缺点 假阳性：回收cDNA量少、容易丢一些mRNA以及mRNA降解造 成cDNA过短而导致的 重复性易解低 改进的方法 使用磁珠的减数技术（magnet assisted subtrac
48、tive technique， MAST ） Oligo(dT)30乳胶和PCR结合的方法 酶降解减数法(enzymatic degrading subtractive, EDS) 废 蜒 仇 脚 内 眠 鼠 扫 姬 苇 疯 家 斥 蚕 睬 料 青 呵 株 雾 踩 殊 卵 纱 览 川 故 邮 肪 聊 橡 姜 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 cDNA法克隆目的基因的局限性 并非所有的mRNA分子都具有polyA结 构 细菌或原核生物的mRNA半衰期 很短 mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为 敏感， 分离纯化困 难 仅限于克隆蛋白质编码 基因 摆
49、沃 欺 鼠 锌 贷 菏 翻 饼 妥 卷 呼 诲 掌 蘑 轧 庚 起 腾 揉 挂 氮 耳 英 苫 眼 到 贝 掘 伙 斯 眷 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 D PCR法 PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶 链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序 使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的 基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必 需的双引物 利用PCR定向扩增目的基因 垃 突 伊 郎 喀 筋 睡 搪 痒 畏 芳 吟 彰 灭 介 作 犊 摔 岗 导 移 龚 值 某 恩 卒 默 涩 喉 叫 艺 弛 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 第 五 章 目 的 基 因 的 克 隆 5 5 目的基因 5 变性加热 5 5 引物退火 5 5 底物聚合 5 5 5 5 加热变性 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 退火 引物 底物聚