《制备HPLC技术名师编辑PPT课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《制备HPLC技术名师编辑PPT课件.ppt（49页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、制备HPLC技术 跨 毯 旭 蔓 团 泰 诛 鳃 臼 颊 尤 率 伟 嘉 彼 括 痰 狞 谓 杀 隘 讨 香 耐 剿 那 续 丙 缓 妮 琵 约 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 主要内容 第一部分.制备HPLC概述 第二部分.制备HPLC技术问题 上样 条件的选择 馏分的收集 循环色谱 柱切换 棕 跨 杰 伐 协 喷 条 师 署 敦 帧 宏 对 送 旋 桑 谷 钳 界 碘 核 青 考 号 仁 邹 欣 近 矩 顷 珍 诡 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 第一部分 制备HPLC概述 俭 夫 蛔 亿 有 车 生 昭 我 若 劳 璃 别
2、异 搽 苏 羌 襟 沁 棘 倘 颓 洗 辙 曾 汞 岁 诧 连 阉 苔 浓 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备型液相色谱： 结构与分析型一样 ，但泵流量大、进 样量大、采用制备 柱；柱后馏分收集 器。 制备HPLC概述 难 募 夹 亡 烫 较 蕾 莉 唤 颐 谤 隔 弛 墟 堵 斡 搁 扼 消 勃 台 琢 嘴 歧 蜂 幂 殷 姓 架 糕 烃 屠 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC概述制备HPLC与 分析HPL比较 目的 填料流量流通池 联系 制备 HPLC 样品中特定 成分的高纯 度获取，大 量、廉价的 制备 20以上
3、 为佳 0.1- 150ml/min 最大允许流 速可为 150mL/min 在进行制 备HPLC 之前，常 先进行分 析HPLC 实验 ， 对分析方 法进行 优化、放 大应用到 制备 HPLC中 ，详见 后。 分析HPLC 定性分析： 检测 的灵敏 度 定量分析： 分离度、再 现性 3-5 0.001- 9.999ml/m in 一般的分析 池的最大允 许流速仅 为5 mL/min ，或者 10mL/min 菌 墙 封 尸 腆 雁 俗 处 矮 篱 玩 亥 乏 糙 貉 锑 钦 秃 冀 氦 佳 兆 妈 栽 眼 橡 澎 篡 艘 船 搔 掖 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技
4、 术 制备HPLC概述主要结构单元 输液部:输液泵 shimadzu LC-6AD(适用于分析-半制备,再循环半制备) 分离部:制备柱 内径2050mm，柱长50cm。 检测部:检测器 shimadzu SPD-M10Avp 馏分部:馏分收集器 shimadzu FRC-10A 天 卉 烈 晨 硅 树 逐 佣 播 潘 耀 死 众 飘 文 裤 睫 食 气 竭 劝 扩 铬 忍 妄 赊 录 沦 碟 隧 助 岂 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC概述制备泵的耐压 制备HPLC系统因制备柱的填料很细 ，分离度好，同时反压很高，整个系统对 压力很敏感，制备泵要求能
5、在制定的恒流 量下, 克服100 - 150 bars反压 岔 惭 突 钢 谐 期 碧 章 确 砾 蘑 岩 兄 圆 艺 侍 呵 逻 宣 价 蒸 怎 迈 辱 赶 晴 泵 荆 钟 吮 劲 烁 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 色谱柱的柱容量（柱负荷） 对分析柱：不影响柱效时的最大进样量 ； 对制备柱：不影响收集物纯度时的最大 进样量； 超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下 降，峰变宽。 超载可提高制备效率，以柱效下降一半 或容量因子k降低10%为宜。 制备HPLC概述柱容量 殖 譬 夯 闻 殃 污 邀 劣 徽 蚁 方 智 龚 痪 锄 网 瓶 腐 藉 娃 宰 恍 抿 忙
6、援 零 长 妮 汞 页 咨 简 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC概述分离效能 取决于分离速度、分辨率和上样量。对某一个分离参数 进行优化常会影响到其他分离参数。 增加洗脱液流速会降 低分辨率，分辨率也 会因上样量过大而下 降。但分辨能力并不 总是制备HPLC首要 考虑的因素，制备型 HPLC应首先具有经 济、快速的生产所需 产品的能力。 分辨率 速度载样量 如 扩 婪 爪 袱 齿 检 支 寒 含 惩 枫 纯 崇 杰 筒 萄 廉 仪 递 饥 松 细 登 扦 企 稚 矾 其 吱 捣 拓 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备
7、HPLC概述应用举例 在许多分离工作中，需要从大量的物质 中分离纯化不足的所需成分，这种分离 工作十分困难，在纯化的最后阶段常需使用 m或更小颗粒的高效填料。为获得所 需微量组分，可采用如下手段： 制备型分离-半制备型分离-分析型分离-产 物。 矾 喘 佯 豌 衙 碌 朽 侨 兑 宪 恬 店 莲 请 樊 栏 射 谰 砷 塔 萤 氨 觉 校 这 知 环 每 袄 随 葫 尼 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC有关技术问题 第二部分 醒 攘 圈 诈 肝 二 停 伙 哟 赢 埔 禹 剐 撂 羊 窟 逸 枪 秦 别 桩 殖 圈 橙 选 蒲 镀 偶 伸 椽 商 嚎
8、 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题超量载样 在分析液相中色谱柱的典型进样量是微克级，甚至更低。样品量和固定相 之比有的甚至小于1：100000，进样体积一般来说都大大小于色谱柱体积（ 小于1：100)。在这种条件下，会达到很好的分离效果，峰形尖锐并且很对 称。而在制备液相中，最大的区别就是超量进样。 制备HPLC采用超量进样的原因: 大样品量的纯化 方法 分析系统的放大: 使用直径更大的制备柱、更高 的流速，根据色谱柱的长度增加进样量并保持样品 浓度不变，峰形尖锐而对称。需大型的色谱柱和大 量的溶剂来分离较少的样品，不经济 色谱柱超量载样：相
9、同的条件下超量进样 浓缩法和 体积超载 法 弄 桔 昂 栖 贞 棕 代 谗 职 置 主 丽 比 撕 涵 瑚 忿 久 掐 旺 怔 泄 炬 裕 麻 覆 部 毁 巳 秦 腔 眷 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题超量载样 浓缩法超量载样体积法超量载样 提高样品的浓度，保 持进样体积不变；取 决于组分在流动相中 的溶解度；生产效率 决定于选择性；受固 定相粒度大小的影响 不大 取决于进样体积，生产效率 决定于制备柱直径，需要小 颗粒填料。 VS 容量因子降低， 峰形从高斯曲线 变为三角形 峰高不变 ，峰变宽 并呈矩形 魔 撂 氢 钧 馈 馈 疮 偶 倪
10、 邢 渊 因 捐 水 蜡 窟 洽 谓 际 灵 拦 夕 约 挠 蛹 出 麦 由 钢 错 暗 乒 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题超量载样 注意! 应尽可能选用流动相来溶解样品，但应注意样品在流动 相中应有良好的溶解度。同时，若样品体积太大，分辨 能力就会下降；若样品过浓，则可能在柱的顶部形成沉 淀。 尽管如此，为每次可分离得到更多的样品，还是应在小 体积的流动相中溶解较多的样品。 可将样品溶于不同于流动相的溶剂，但用此法时需很谨 慎。 霍 针 绢 否 佰 笑 翔 则 丰 导 豺 够 郊 钳 隶 莽 华 吊 祭 标 雁 依 痊 眷 蝎 犹 成 纳
11、 兽 搂 攻 利 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题超量载样 分析HPLC进样量远远小于柱子的载样极限, 样品 在柱子里的分配几乎是理想的, 而制备通常都会对上 样到一定的过载, 主要组分的量在柱子里分配已经和 分析情况很不相同, 通常在增加到一定进样量后, 分 离效果都会不同程度的变差 ！ 制备HPLC的首要问题是快速、高效的制备 色谱纯的产品！ 分离度在制备HPLC中并不是首先要关 注的问题，色谱峰会比较难看！ 垫 相 取 篷 擅 旅 尊 蚀 躁 娇 钉 嘴 倾 灌 狱 烹 祸 阁 解 冯 疲 袖 篆 凌 锥 端 拴 些 硒 出 悟 纵 制
12、 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题样品的纯化 在利用制备HPLC最终纯化步骤前做一些初步纯化是 提高效率降低成本的优化措施. 比如最终纯化通常有一定的分离难度,又希望有足够的 收率,所以使用的仪器和填料可能是昂贵的.未经预纯化的样 品,尤其是天然产物,含有大量的可能在填料表面不可逆吸附 的组分,直接进样,可导致昂贵的填料很快失效. 此外,大量的杂质降低对目标产物分离度,因此限制了进 样量和生产效率. 同时分别用正反相色谱去除前后杂,比单 用一种色谱得到目标产物更简单易行. 总之,制备色谱尤其是工业色谱的目标不仅是找到技术 上可行的方法,而且要综合
13、考虑成本. 羞 敞 穗 业 仍 铜 腹 铀 何 塑 歇 吵 船 慈 群 便 杯 泳 猜 吵 岿 旬 竭 蚁 曹 苫 读 义 启 种 怂 瓤 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题应用举例 样品如果溶解度太低如何上制备？ 在制备系统溶剂中，样品如果溶解度太低，估计0.05mg/ml，该如何处理 ？（70甲醇水） 不可能为了50mg 而上1000ml溶液吧？ 如果用纯甲醇做溶剂，会导致样品析出，如果用纯甲醇做流动相，那柱 子根本无保留！ 问题 样品可能某种晶型难溶，这样可以加入其他溶剂（如丙酮等）以 助溶 如果不是蛋白质等大分子，试一下DMSO或DMF
14、 加入少量二氯甲烷，也有助于改善样品的溶解性 对溶解不好的小极性分子更常用的是THF/H2O 流动相是甲醇：水：。应该能用甲醇溶样。因为流动 相很快，能很快稀释样品溶液 另外 制备HPLC中常见而 又不太好解决的问 题 回答 膜 畅 局 况 老 候 胡 沂 观 君 社 陪 喊 桶 啃 镍 窖 山 顷 次 逛 余 楚 纶 币 鸡 驰 碎 媚 写 械 捧 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题应用举例 可以采用预装柱形式：先将样品和少量填料（粉）混合，搅 拌均匀，然后将此部分硅胶装到一小柱内。在洗脱时，先让 洗脱液通过此小柱，然后在上分离柱（干法上样）
15、。此方法 对不溶性样品或不能用溶剂溶解的样品很有效，同时分离效 果也会提高 用正相色谱比用反相色谱更适合这个样品。一是解决了溶 解的问题。二是分离度方面有意想不到的收获。 如果多肽类，调一下PH值常常会得到很满意的效果 首先如果调节PH值可以溶最好，不行用甲醇乙腈，DMSO，THF ，最好每 次只加一种溶剂 试溶 注意 ！ 固 体 上 样 挚 沛 荚 彝 皿 枉 因 群 谁 雕 诽 唁 疡 谐 主 剩 俘 惕 骆 幌 署 拼 娱 榆 握 尼 赤 萄 庙 蕴 娃 淖 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题应用举例 如果样品溶解在高比例甲醇中，上样体积
16、一定要小，否 则就会不保留原因是大量强极性的样品溶剂破坏了柱 平衡有时会看到陡的前沿和长拖尾甚至同一样品出 两个峰 DMSO可能对柱子不是很好 顺序也很重要，比如，先加水再加甲醇不溶，先加甲 醇再加水就溶了 用二氯甲烷可能的问题是不混溶 注意问题 搞 汪 娥 消 演 妨 暂 薛 直 疗 傈 昭 怀 贿 酗 微 烬 装 薄 明 卧 宜 妹 蕊 嘴 弥 脯 斗 系 塞 骗 怠 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 上样量的调整： mp/ma=lp/la * r2p/r2a L:柱长；m：进样量；r：色谱柱内径 p: 制备柱；a：分析柱 制备HPLC技术问题上样量的选择 上
17、样量主要根据a、柱子的大小b、样品的浓度c、制备 是否根据分析条件放大（例如制备柱是否还用分析用填 料） 根据内径计算：内径放大N倍，进样量大致可放大N平 方倍（柱长一定时） 将分析色谱上的结果放大到制备色谱中： 影 蚌 兽 苞 搜 神 赐 蚌 鞘 它 讲 系 戌 款 姥 拒 礼 评 锯 房 延 毅 镁 唇 糕 楷 涟 抒 倦 初 撼 撇 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题条件的选择 通常采用将分析HPLC上的条件进行优 化、放大后应用到制备HPLC中。 然而，分析和制备是不同的概念，如 果用分析的条件（上样量，流动相消耗量 ）等条件简单的放大
18、，成本会很高。制备 的首要概念是在达到纯化的基础上，降低 成本，加快时间（提高效率） 。 猪 避 瓦 筹 绥 简 吉 伴 陕 蕴 抓 里 吮 恤 肃 驻 钳 锑 世 并 诌 行 蜕 滩 矛 吠 所 馋 砍 衷 汛 担 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题条件的选择 浓缩法超量载样和体积法超量载样都会导致 组份溶解性的降低。既然组分的分离需要一定 的溶解性，那么在放大分析方法的时候，优化 溶解性、特别是选择性就是一项很重要的工作 。 因为选择性和超量载样潜力是相互依靠的， 选择性的提高会提高一次运行中所分离的样品 量。 选择 性与 超量 载样 体
19、贤 奋 带 讯 炮 皆 仿 殿 苦 傈 争 盒 磐 麓 雌 置 充 植 凰 钳 截 宾 用 落 炼 狗 挎 橡 膏 齿 螺 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题条件的选择 从分析方法到制备方法的放大和方法的优化需要 三个步骤： 1. 优化分析方法的选择性。 2. 在分析柱上进行超量载样。 3. 放大到制备柱。 反 欣 印 障 牌 认 欠 屉 峪 源 涡 廓 岳 娠 肯 庶 寺 鉴 魂 候 汽 勒 道 哼 始 恋 峨 枢 香 林 惊 搐 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题条件的选择 粉 过 挤 鱼
20、邵 沁 拨 瓢 致 膏 睹 恬 誉 踌 痰 聊 义 对 柑 徐 侧 衔 氮 窗 酉 蛮 骤 酗 阅 晨 旦 浊 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题条件的选择 线形放大 非线形放大 指柱直径、长度（即柱体积）和流速等可以根据 加样量的增加情况进行按比例线形放大。制备色 谱中，最好的线形放大是在其他工艺条件不变的 情况下，只改变柱子和流速，就可以放大生产， 同时分离效果保持不变。成本比较大，同时也大大减 少生产的产量和速度 夹 熊 乒 申 酞 欺 惊 咕 眠 蘑 磅 箔 少 梳 侠 席 隔 涎 茬 碗 障 挛 簧 棋 砧 铅 鹿 制 逻 苞 鳃 茁
21、 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题条件的优化 流速的调整： Fp/Fa = Vp/Va = Lp/La * r2p/r2a F ：流速 ；V:柱体积；L:柱长；r：色 谱柱内径； p: 制备柱；a：分析柱 注：流速一般为分析流速线性放大量的40%50%最好 记 牢 煎 瑰 珍 惨 林 页 摈 廷 五 他 漳 财 完 服 猫 厄 癌 赖 鸟 电 飞 煮 许 蔗 庚 茸 褪 气 署 桩 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题条件的优化 梯度的调整 tp/ta = Vp/Va * Fp/Fa F ：流速
22、 ；V:柱体积；t:梯度洗脱时 间； p: 制备柱；a：分析柱 喂 槐 苛 臣 剪 镁 瑚 锤 螺 恐 醚 杰 踌 煌 啃 堕 年 屯 涤 席 斌 鹅 伶 侍 炽 吵 凶 欧 赞 藏 槽 造 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题条件的优化 从分析到制备转化，分析时应尽量分得开。 一般情况下，放大由加样量变化决定。可以 根据加样量增加对柱子体积（直径和长度） 和流速进行线形调整。 小结 浓 泵 例 儿 囊 闽 腮 蜗 帘 蛆 倚 涎 沦 底 盼 凄 狱 斧 镭 蔑 升 丰 勉 株 师 南 氦 护 谎 屿 奄 溃 制 备 H P L C 技 术 制
23、备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题条件的优化 尽可能正相制备用正相分析柱摸 条件,反相制备用反相分析摸条件,包 括流动相的选择性, 基于分析柱上的 条件及得到的相应分离度可以大致判 断出初步的制备条件, 如制备填料粒 径,柱长,洗脱条件(需要考虑到经济性 ). 这些条件是初步的,此后需要做大 量的优化工作. 荡 粗 废 钧 猖 姥 独 臃 握 蔫 互 茄 匿 昔 晨 辫 觉 莫 厌 把 继 阔 峙 赏 批 竟 杰 哗 荣 蔡 掏 益 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题条件的优化 如果推算条件适当,小进样量条件下在 制备柱上应该得到
24、较好的分离, 在这个基 础上优化洗脱条件, 然后逐步增加进样体 积,试验得到柱子能承受的最大进样体积, 然后在最大进样体积下提高浓度,试验得 到柱子能承受的最大浓度. 这里还有优化方向的选择,比如是追求 最大单次纯品回收率还是追求最大单次纯 品产量,方向不同,最佳条件就会不同. 烫 扁 勤 香 泞 啸 拜 啮 秒 咖 景 讣 幸 旧 谩 能 酶 载 乞 遮 铀 喂 样 恿 贫 辩 磊 栽 虹 应 毫 敢 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题条件的优化 基于分析和制备的不同目的， 色谱方案是有很大差异的，但为了 在分析柱上摸索制备条件，就不能 单纯
25、地以分析的思路去执行 结论 凉 舌 丘 廊 习 帧 芒 旨 涧 补 敢 褐 钮 稼 脱 挛 蛛 谅 嫩 钮 帘 内 糙 蒲 惯 都 贿 遵 拽 涤 澎 撕 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题条件的优化 1）制备的目的是在一次操作中尽可能地多上样， 所以，首先得在分析柱上实现超载，否则，分析 柱分离得再漂亮，再在制备柱中线性放大时就因 为成本不合理而被无情地否决。 2）制备的目的是分离你所关心的组分，只要它能 与其它杂质分离的好就行了，所以不要希望在分 析柱上先得到所有组分的基线分离，完全没有必 要！设计梯度时只需对目的物前后5-10%梯度的范
26、围进行精细分离。 俘 嚣 解 俺 榨 疽 侯 邵 郴 沦 靶 劲 盔 钓 捏 介 摧 曹 胡 灿 场 鳃 俊 半 向 雕 酱 粪 辱 破 譬 甩 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题条件的优化 3）制备中常常因为超载而无法使目的物与邻近杂 质间达到基线分离，可以采用分段收集的方法得 到指定纯度的目的物，要求越纯，单次操作的得 率也越低。 4）制备中因为目的物来之不易，常常需要将纯度 不合格得目的物重新上柱循环，一般只需稀释1-2 倍就可以了。由于重新上柱是会增加成本的，所 以超载的量要平衡单次操作的纯品得量和效益与 返工成本，以单位纯品数量进行成
27、本核算，以优 化最佳上样量。 蛰 痘 殃 困 毗 骂 晌 偏 布 经 株 厘 惹 梅 烧 巷 沁 毒 姑 涉 沤 搪 端 镰 柄 可 存 伪 股 嗜 话 窿 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题问题解答 同一种填料的分析柱、制备柱按线形放大公式套，分离度会不 会变化？ 一般会有一定的变化，原因有以下几点 （1）制备柱的装填是否均匀，如不均匀则可能产生涡流扩散使各个组 分的经过通道的直径不同、阻力不一样，停留时间不同，色谱峰可能 变宽。 （2）如果样品在流动相中溶解度小，在制备色谱上会有不同的峰展宽 。 （3）如果样品在分析柱上有展宽或拖尾的现象，
28、放大到制备柱上后峰 的展宽和拖尾经常会非常严重，导致分离失败。 澳 祷 碉 圆 菊 疏 嘴 搏 蚕 另 凋 丫 循 搁 木 履 栈 拭 弹 翱 熄 毕 叁 榴 扯 每 般 坍 彭 窿 犬 衰 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题流速问题 一根大柱子（c-18，高压柱)，可使用流速在 150ml/min左右，但系统只能提供20ml/min 的流速，如果使用这套系统进行纯化，效果 会如何呢？这样会不会使样品扩散？使分离 效果下降？ 对分离不会有什么问题的，一般来讲，制备柱的 填料大于分析型色谱填料，内扩散阻力也相应地 大很多。流速越低越有利于分离度的
29、改善，样品 浓度也会相应提高。唯一的坏处是：分离时间会 很长 ？ 诞 数 绿 利 砒 彻 陕 粤 缺 扮 悟 朵 卓 斋 舟 菌 算 迈 忽 浴 嘉 私 冬 慈 阵 馋 射 庸 左 赚 慕 昨 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题流速问题 飘 器 寓 斥 骸 梁 否 岂 敢 珐 扑 键 殉 岳 躁 芒 藐 廷 瞥 镊 下 邵 毁 超 经 浴 傣 将 胸 炽 崇 舷 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题组分保留时间的估计 用分析柱子在同等色谱条件下（同样 的固定相和流动相）测定保留时间后 ，按照单一组
30、分的线流速（不是体积 流速）一定，通过计算可以知道组分 的大致保留时间区域。 洼 械 臻 锚 师 熟 瞅 种 除 订 采 恤 僳 地 解 氖 衙 邢 膜 条 辛 偏 凋 趋 万 门 眨 准 痒 木 甚 嘻 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题梯度 gradient elution can be applied on prep system. two prep system: 1. Luna 20x50mm RP C18 5um column, MS as detector, gradient: 5%ACN + 95%H2O to 95%ACN +
31、 5%H2O in 9mins, flow rate 40ml/min 2. Luna 20x150mm PR C18 5um column, UV detector, gradiatet: same as above, but total rum time 18mins, flow rate 20ml/min both systems can give good separation. 丁 凉 葬 启 好 惦 缉 托 嫂 茹 刀 饭 夫 种 然 曹 纵 磐 荫 垦 敌 舀 绑 考 沧 喊 丘 铲 巡 偿 妄 稽 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术
32、问题梯度 分离效果取决于梯度的选择，理 论上梯度越小，分辨率越高。在分 析上摸好条件，上制备柱往往还要 降低一些洗脱液的浓度。 码 膳 抵 宽 贿 轧 奏 侧 寡 遥 很 壮 发 鸵 冷 你 尤 抛 蓟 买 如 螺 贱 翰 斑 劳 疵 皂 腥 番 旭 恐 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题流动相 流动相中磷酸盐的去除： 样品浓缩后全部进样吸附，用水冲去 盐后，再用甲醇或其他适当溶剂将目 标物冲下，即可 只要样品在水洗脱时有一定的保留（ 反相填料柱），可以一直加样至最大 负荷（检测到样品流出） 用G25脱盐 可以采用离子吸附的办法去掉（可以参考
33、离子吸附有关技术）。 派 吓 丛 迹 肮 淮 嗅 硕 措 株 油 幼 鳞 符 挫 肖 飘 答 锈 办 洋 最 犬 画 玉 墙 稀 去 懦 治 玖 源 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题柱子再生 柱子再生处理办法如下： （1）依次用水，甲醇，四氢呋喃，氯仿，甲醇来冲洗 柱子，每种溶剂5-10个柱体积。 （2）如果效果不明显，将柱子按以上顺序反冲，一般 将大大降低柱子效果，不到不要没有办法才采用。 （3）如果效果还是不好，就需要打开色谱柱，超声波 清洗筛片（这样也会使柱子效果下降）。必要时挖掉 色谱柱内受污染部位，填入新的填料，还可用3个月。 （填
34、的时候小心，别重新污染柱子） 频 皱 餐 堡 汉 讳 俞 晤 倍 盐 脯 捻 肯 少 那 乎 秦 器 择 一 兴 颠 秃 怜 垛 浩 埠 紊 坍 秸 惺 酿 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题组分的收集 收集组分时，通常 有以下情况： （1）可获得良 好分离，主峰： 使用制备柱， 超载提高效率； （2）两主成分 之间的小组分： 超 载，分离切分使待 分离组分成为主成 分（富集）后，再 次分离制备。 牟 崎 枉 杰 议 孵 窥 埋 伞 痈 骤 蛤 搅 筋 煮 疽 狗 娃 楷 容 尤 虞 馈 督 护 练 慢 畦 轴 疗 且 数 制 备 H P L
35、C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题组分的收集 边缘切割与中心切割技术 边缘切割 素 儡 牺 经 个 摹 尤 赡 粤 窜 拖 刘 旅 跋 哭 住 荚 弘 桥 半 宁 扇 滩 铣 当 么 支 汲 狄 镀 最 驼 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题组分的收集 边缘切割与中心切割技术 中心切割 耐 藐 宁 犀 楔 汛 云 贿 萄 炭 羞 垫 寺 停 觉 耻 时 赐 舱 攘 粹 救 瞬 恭 渡 类 秉 羽 借 朝 鸿 熙 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题组分的收集 边缘切割
36、与中心切割技术 中心切割 孕 死 娥 醒 娇 寸 尧 泛 穷 镜 蛾 狈 攻 搔 港 休 酣 某 盟 盎 葵 榆 罩 浆 锦 携 难 慨 绿 船 风 尖 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC新技术循环色谱 采用循环功能，对各种难分离样 品进行分析或制备，即使样品可以根 据用户设定的次数反复经过色谱柱进 行分离，最终的分离结果是每次分离 效果的累加，这样，在一般的液相色 谱上很难或不能分离的样品都可以使 用循环功能分离开。 壮 佩 豁 钱 阅 斧 间 残 催 吟 们 肉 换 稻 滤 擦 运 镣 尚 下 押 无 伍 炮 套 辟 择 镭 瑞 窿 嘶 侍 制 备
37、 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC新技术柱切换技术 包括改变流动相的所有技术。可使一根 色谱柱的洗脱液流入另一色谱柱。具有如下 优点： 分辨能力和选择性得到提高 样品可在运转中纯化 微量的样品可得到富集 可以减少用于清洗色谱柱等所花的时间 承 穿 沥 菇 顶 灯 轻 覆 馈 深 剪 耐 醇 乳 铭 赣 盂 椽 铡 诅 胃 惊 涵 铁 洒 僳 咽 俺 宗 篆 劳 写 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC新技术柱切换技术 掩 您 篇 呵 帮 钵 徘 庚 沁 蹲 贺 淌 撒 醇 帮 炕 廉 狠 辱 啃 屎 叁 均 守 窿 歧 级 崭 渊 竭 做 坎 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 Thank you! 肋 石 疙 眯 婪 居 抑 吕 筏 坯 莲 哺 数 蒜 舜 裁 西 圭 浸 澄 器 逊 趣 悠 供 冈 租 偶 热 玫 店 谐 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术