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1、PCR技术检测海运船舶压载水病原弧菌初探关 键 词:压载水; 病原弧菌; 聚合酶链式反应; 毒力基因 HUO Ying-|yi1, XU Xue-|wei1,2*, WANG Chun-|sheng2, HUANG Lei3, WU Gang3, WU Min1(1.College of Life Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China; 2.Laboratory of Marine Ecosystem and Biogeochemistry, Second Institute of Oceanography, State O
2、ceanic Administration, Hangzhou 310012, China; 3.Zhoushan Entry-|exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhoushan 316000, Zhejiang Province, China)Detection of pathogenic Vibrio in the ballast water by polymerase chain reaction.Journal of Zhejiang University(Science Edition), 2010,37(3):330-334Abstra
3、ct: The potential of ballast water to act as a major vector for invasive alien species has long been recognised. Invasive alien species caused by ballast water frequently outcompete or prey on native species and spread diseases to plants, animals, and human. They often encroach on, damage, or degrad
4、e assets and result in significant economic impacts. Vibrios are highly abundant in marine environments. Some of them such as Vibrio cholerae, V. vulnificus and V. parahaemolyticus are pathogenic for human being. An international ballast water performance standard, which prescribed Vibrio cholerae (
5、O1 and O139) with less than 1cfu per 100 mL, was adopted by the International Maritime Organization (IMO) in 2004. Multiple pathogens in ballast water samples from Zhoushan archipelago located in the eastern of China were detected. Two virulence-|associated genes (hlyA and vvh) usually from V. chole
6、rae and V. vulnificus were detected by polymerase chain reaction. The molecular library containing 16S rRNA gene of Vibrio was constructed subsequently. The results indicated that some V. parahaemolyticus-|and V. fischeri-|like strains existed in the ballast water sample S1. It was concluded that th
7、e ballast water sample contained some pathogenic Vibrios. This paper presented new molecular data based on virulence-|associated gene and LSU-|rDNA sequences that demonstrate a rapid and effective method for detecting pathogenic Vibrio in the ballast water. Key Words: ballast water; pathogenic Vibri
8、o; PCR; virulence-|associated gene 压载水(Ballast Water),是船舶为提高吃水能力、保持浮力和控制船舶稳定性而装载的水1.每年全球船舶携带的压载水约有35亿吨2,每天随船舶压载水周游世界的生物约7 000多种3,这使压载水已成为海洋生物入侵的主要载体.随着世界贸易和经济全球化的发展,船舶变大,船速变快,船舶在两港间航行时间缩短,更增加了外来有害生物存活和转移的可能性.压载水介导的生物入侵,可能引发流行性疾病、破坏渔业生产、产生遗传污染、导致生态危机,造成经济、环境、卫生和安全等方面的灾害性后果,已被全球环境保护基金组织确定为当前世界海洋所面临的四大
9、威胁之一. 面对压载水引发的诸多问题,2004年国际海事组织(IMO)制定了关于船舶压载水及其沉积物管理和控制的国际公约(以下简称压载水国际公约)1.该公约详细规定了压载水的置换与性能标准,然而当前采用物理、化学和生物等方法处理压载水,难以完全清除所有外来物种,尤其是个体较小的病原微生物4.因此,针对处理前后的压载水,构建病原微生物检测体系,已成为世界各海洋国家亟待解决的问题. 弧菌是一类广泛分布于海洋、动物肠道等水生环境的细菌.目前已知弧菌属(Vibrio)中可引起人类疾病的有12种,包括霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血性弧菌(V. parahaemolyticus)、创伤
10、弧菌(V. vulnifucus)等;某些弧菌可导致海洋动植物疾病,如费氏弧菌(V. fischeri)、哈维氏弧菌(V. harveyi)等5.压载水国际公约中明确规定,压载水中致病性霍乱弧菌是主要检测指标,其数量应少于10个/L1.我国政府也规定需对装自霍乱疫区的压载水实施检测6.然而传统检测霍乱弧菌的方法,往往采用分离培养和生理生化测定,该方法存在实验周期长且漏检率高等局限.因此,建立和发展一套快速有效的病原弧菌检测体系,是防止外来物种入侵、保证生物生态安全的重要举措.本研究采用选择性富集培养和PCR扩增弧菌毒力基因相结合的方法,初步建立了一种基于基因指纹技术的快速检测压载水病原弧菌的技
11、术方法. 1 材料和方法 1.1 样品采集与保藏 压载水样S1采自停泊于舟山岙山岛30万吨远洋船舶;压载水样S2采自停泊于舟山册子岛7万吨船舶.样品于4 低温保藏. 1.2 环境样品总DNA提取 压载水样经0.22 m滤膜过滤后收集微生物菌体,环境样品总DNA的提取参照ZHOU J Z等7的方法,并使用Wizard DNA Clean-|up System试剂盒(Promega,美国)纯化总DNA. 1.3 压载水弧菌毒力基因快速检测 分别接种10 mL压载水样品至200 mL DSMZ 308(Vibrio Medium)和APW5培养基中,28 震荡培养24 h后收集菌体.酚氯仿法抽提菌体
12、DNA.采用聚合酶链式反应(PCR)法分别扩增富集菌体DNA和样品总DNA中的弧菌毒力基因序列,包括霍乱弧菌毒素基因ctxA、溶血素A基因hlyA、毒素表达蛋白调控基因toxR,副溶血性弧菌耐热直接溶血毒素基因tdh和溶血相关毒素trh,以及创伤弧菌溶血素基因vvh.引物信息及PCR条件见表1. 1.4 压载水弧菌16S rRNA基因多样性分析 对检测到弧菌致病性基因的样品,构建弧菌相关16S rRNA基因文库.PCR扩增引物为细菌通用引物27bf:5-|AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-|3;和弧菌特异性引物680br11:5-|GAAATTCTACCCCCCTCTACA-|3.50
13、 L反应体系为10buffer 5 L,dNTP 0.5 L,引物各1 L,Millipore无菌水41 L,压载水样品总DNA 1 L,Taq酶(TaKaRa,日本)0.5 L.PCR反应条件为50 L反应体系加入50 ng DNA模板,33个循环;变性94 ,30 s;退火55 ,30 s;延伸72 ,60 s. PCR产物经琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒(TaKaRa,日本)纯化后,连接pMD-|19T(TaKaRa,日本)载体,转化Escherichia coli DH5感受态细胞.经蓝白斑筛选,质粒抽提,电泳检测,然后以质粒DNA为模板,以弧菌特异性引物567 bf(5-|GGCGTAA
14、AGCGCATGCAGGT-|3)11和680 br为引物PCR扩增检测阳性克隆.重组子送北京诺赛基因组研究中心有限公司完成DNA序列测定,引物为M13. 获得的16S rRNA基因(16S rDNA)序列通过EzTaxon数据库进行比对12,得到与其相似性较高的序列.采用Mega3.1软件中Clustal W程序进行多序列匹配排列,并使用Neighbor-|Joining算法构建系统发育树. 2 结 果 2.1 压载水弧菌毒力基因检测 采用DSMZ 308和APW两种培养基,以5%接种量,通过富集培养微生物结合PCR扩增弧菌毒力基因的方法,检测压载水样品中病原弧菌.样品S1环境样品中未能直接
15、检测获得毒力基因;但水样经DSMZ 308培养基培养后,富集液中检测获得vvh基因经APW培养基培养后,富集液中检测获得hlyA和vvh基因.样品S2环境样品和富集液中均未能检测获得相关毒力基因.结果表明,样品S1中含有霍乱弧菌和创伤弧菌的毒力基因. 2.2 压载水样品S1中弧菌多样性分析 采用PCR结合TA克隆的方法,获得上百个克隆子,从分子文库中筛选获得32个含正确插入片段的克隆子.测序结果表明,重组子序列分别属于-|变形菌纲下弧菌目的Vibrio属和交替单胞菌目的Pseudidiomarina与Idiomarina属.5个序列与副溶血性弧菌和费氏弧菌相似(见图1),占文库总克隆子数的15
16、.6%. 3 讨 论 弧菌是一类广泛分布于海洋、动物肠道等水生环境的细菌,多种弧菌能引起人类和海洋动植物疾病.比如,霍乱弧菌(Vibrio cholerae)和副溶血性弧菌(V. parahaemolyticus)可引起急性消化道传染病;创伤弧菌(V. vulnifucus)可引起创伤感染和原发性败血症13;费氏弧菌(V. fischeri)和哈维氏弧菌(V. harveyi)通常与由寄生虫、病毒、粘细菌引起的混合感染症状有关14.1991年,南美洲霍乱流行,同年在美国阿拉巴马的牡蛎中发现了与拉丁美洲流行菌株V. cholerae O1相似的致病性霍乱弧菌.随后检查主要来自南美洲的19艘海运货
17、船,发现其中5份来自疫区船舶的压载水中携带流行性霍乱弧菌,证实压载水是导致外来微生物入侵、传播流行性疾病的重要途径15.鉴于压载水的潜在危害,压载水国际公约明确规定,近海域装载的压载水需在远离大陆的公海交换压载水.然而,有研究表明,远海交换压载水并不能降低压载水中的微生物量16.因此,交换压载水只是降低流行病地区带来病原微生物的可能性,但很难保证重新装载的压载水不具有危险.可见,建立一种压载水病原微生物的快速检测手段的重要性和必要性. 本研究以5%接种量对压载水样品S1和S2进行短时间富集培养,基因组抽提后采用病原弧菌毒力基因特异性引物进行PCR扩增.针对多种弧菌毒力基因,设计针对致病性弧菌毒
18、素及其表达调控基因的多对引物,区分不同弧菌并尽量减少漏检率.样品S1中检出hlyA和vvh基因,证实了该压载水样品中含有病原霍乱弧菌和创伤弧菌的毒力基因;样品S2中未检出毒力基因,也表明不同来源的压载水在病原弧菌数量上可能存在差异.实际接种量为5%(即将10 mL水样加入200 mL培养基),则理论上样品S1中的霍乱弧菌和创伤弧菌数量可能达到100个/L,为压载水国际公约规定的10倍.研究同时还发现,APW培养基对病原弧菌的富集较DSMZ 308培养基有效.APW培养基培养后富集液中检出hlyA和vvh基因,DSMZ 308培养基培养后的富集液中只检出vvh基因. 目前,压载水病原菌检测往往采
19、用传统的分离培养方法,具有一定局限性,例如:(1) 需要训练有素的微生物分类学专家;(2) 实验周期长,至少需要57 d;(3) 检测人员长期面对致病菌,对健康存在潜在威胁;(4) 有些病原菌属于不可培养微生物,导致漏检率高.鉴于海运船舶压载水排放存在着时间限制,通常保留至船舶到港装货前,因此传统方法并不适合其压载水病原菌的快速监测和有效控制.通过基因指纹技术可实现压载水病原弧菌的快速监测,检测时间可控制在24 h之内,避免传统方法模式的不足,有助于国家快速反应措施的实施.针对样品S1构建弧菌16S rRNA基因文库,克隆子系统发育分析结果表明,压载水样品S1中具有与副溶血弧菌和费氏弧菌有较高
20、相似性的菌株.16S rRNA基因是目前微生物分子生态学调查最为常用的靶基因,但在弧菌属内16S rRNA基因序列高度相似17-18.因此,仅通过16S rRNA基因也很难达到细致区分弧菌属成员的目的,这也给弧菌16S rRNA基因特异性引物设计上带来了困难.研究中使用弧菌特异性引物进行扩增和检测,得到了大量属于Pseudidiomarina和Idiomarina属的克隆子,分别占总克隆数的71.9%和9.4%,从侧面说明了上述问题.因此,寻找可替代16S rRNA基因的靶基因用于弧菌群落分子生态学研究,是今后相关工作需要考虑的内容.但已有结果可表明,压载水样品S1中含有多种对人和动植物有害的病原弧菌,对海洋生态平衡、公共卫生安全和海洋养殖业具有潜在危害. 4 结 论 压载水样品S1中含有病原霍乱弧菌和创伤弧菌毒力基因,对应的病原微生物数量已超过压载水国际公约中规定的最低排放标准.后续16S rRNA基因文库分析直接证实了样品S1中存在病原弧菌.研究采用PCR扩增病原弧菌特征基因技术,结合16S rRNA基因文库构建,对压载水中病原弧菌快速检测技术的构建进行了初步探索,实验结果也说明了该技术思路的可行.但该技术还需要在富集培养时间、菌体DNA抽提方法、多重PCR条件等方面进行优化,最终达到快速且有效的目的.