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1、丙酸氟替卡松乳膏的微生物限度检查方法验证1、仪器 卧式压力蒸汽灭菌器WS-200YDB江阴滨江医疗设备有限公司、立式灭菌器LMQ.C型山东新华医疗器械股份有限公司、YG组装式空调器靖江兴国空调制冷有限公司、生物安全柜BSC-1600IIAz苏州安泰空气技术有限公司、生化培养箱LRP-250广东省医疗器械厂。 2、验证过程 验证方法：照2015版四部非无菌产品微生物限度检查。 2.1 微生物计数法：计数方法适用性试验。 2.2 控制菌检查法：控制菌检查方法适用性试验。 2.2.1 1、菌液制备 检查用菌种：铜绿假单胞菌CMCC（B）10104，金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003，枯草芽孢杆菌
2、CMCC（B）63501，白色念珠菌CMCC（F）98001，黑曲霉CMCC（F）98003 菌株不得超过5代 来源：浙江省食品药品检验所 将上述菌种的新鲜培养物分别接种至规定培养基培养，细菌、酵母菌取此培养液1mL至0.9%无菌氯化钠溶液9mL中，采用10倍递增稀释法，稀释至使菌液浓度小于100cfu/mL；黑曲霉用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL含孢子量不大于100cfu的孢子悬液，备用。 2.2.2、供试液的制备： 取本品10g，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，37保温振摇至供试品分散均匀，即为1：10供试液。 2.2.3、计数
3、方法适用性试验 3.1试验组制备： 3.1.1需氧菌总数测定取1：10供试液9.9mL，5份，每份分别加入金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、白色念珠菌的菌悬液0.1mL后摇匀，然后分别吸取上述混合液1mL注入无菌平皿中，并立即倾注15-20m温度不超过45的胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。每种试验菌平行制备2个皿，以均值作为计数结果。 3.1.2霉菌和酵母菌总数测定取1：10供试液9.9mL，2份，每份分别加入黑曲霉、白色念珠菌的菌悬液0.1mL后摇匀，然后分别吸取上述混合液1mL注入无菌平皿中，并立即倾注15-20mL温度不超过45的沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，
4、凝固，倒置培养。每种试验菌平行制备2个皿，以均值作为计数结果。 3.2供试品对照组的制备：取1：10供试液，以PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌液，同试验组操作，加入相应培养基。 3.3菌液对照组制备：取PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液，按试验组操作加入试验菌液，加入相应培养基。 3.4培养将上述各组含胰酪大豆胨琼脂培养基平板倒置，置3035培养，其中含金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的试验菌的平皿培养3天，含黑曲霉、白色念珠菌的试验菌的平皿培养5天；将上述各组含沙氏葡萄糖琼脂培养基平板倒置，置2025培养5天。 3.5观察和计数对每个平皿逐目检查计数，结果以培养终
5、的计数为准。平行3批样品。 4、验证结果 4.1 需氧菌总数测定结果：供试品对照组菌落计数分别为0、0、0. 金黄色葡萄球菌，3个批号试验组的菌落计数分别为53、54、51，菌液对照组菌落计数为83，相应比值为0.64、0.65、0.61。 铜绿假单胞菌，3个批号试验组的菌落计数分别为18、18、16，菌液对照组菌落计数为19，相应比值为0.95、0.95、0.84。 枯草芽孢杆菌，3个批号试验组的菌落计数分别为28、30、30，菌液对照组菌落计数为34，相应比值为0.82、0.88、0.88。 白色念珠菌，3个批号试验组的菌落计数分别为49、45、47，菌液对照组菌落计数为49，相应比值1.
6、0、0.92、0.96。 黑曲霉，3个批号试验组的菌落计数分别为48、54、54，菌液对照组菌落计数为51，相应比值为0.94、1.1、1.1。 白色念珠菌，3个批号试验组的菌落计数分别为35、34、32，菌液对照组菌落计数为37，相应比值为0.95、0.92、0.86。 黑曲霉，3个批号试验组的菌落计数分别为35、33、38，菌液对照组菌落计数为45，相应比值为0.78、0.73、0.84。 4.2经上述实验证明，采用平皿法检验丙酸氟替卡松乳膏供试品对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率能够到达中国药典要求。 5、控制菌检查方法适用性试验 本品为外用制剂，控
7、制菌必须检查金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌，验证方法如下：金黄色葡萄球菌：取1：10供试液10mL及试验菌1mL接种至100mL的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀。3035培养，1824h。按照中国药典2015年版金黄色葡萄球菌检查方法检查。 铜绿假单胞菌：取1：10供试液10mL及试验菌1mL接种至100mL的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀。3035培养，1824h。按照中国药典2015年版铜绿假单胞菌检查方法检查（表1）。 由上图结果显示，表明供试品在该实验条件下对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌没有抑菌作用或是其抑菌作用可以忽略不计。说明采用此法进行本品的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌检查可行。 6、讨论 6.1本试验中所采用的培养基均按药典要求进行了培养基适用性试验，符合要求。 6.2通过验证，丙酸氟替卡松乳膏采用常规法进行需氧菌、霉菌和酵母菌检查，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的比值都在0.52范围内；控制菌检查中本品对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌没有抑菌作用。结果可为丙酸氟替卡松乳膏的微生物限度检查方法提高依据。