生物工程综合实验样本.docx

1、资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。实验三、重组菌细胞破碎及酶活检测1、 实验目的掌握超声波细胞破碎方法及木聚糖酶活性测定方法2、 实验原理超声波是指频率超过人耳可听范围 (1621kHz) 的波 , 即频率为 20kHz 以上的波。微生物细胞在超声波的作用下 , 细胞结构受到破坏 , 而使细胞破碎。 超声波进行细胞破碎的效果与微生物的种类、 浓度、 超声波频率、 输出功率和破碎时间有密切关系。使用超声波必须注意的是控制强度在一定限度 , 即刚好低于溶液产生泡沫的水平。木聚糖酶的活性一般是测定其水解底物木聚糖后生成的产物的还原末端木糖的增加量来进行的,而木糖的含量能够

2、利用其与某些显色试剂(如 DNS试剂 , PAHBAH) 反应后生成在特定波长下有特异吸收峰的有色化合物,从而经过分光光度法测出。3、 实验材料和设备A. 试剂测定酶活用试剂:在实验一已配制 0.5 % 燕麦木聚糖:0.5木聚糖溶于100 mL 无菌水中 ,在磁力搅拌器上搅拌使之呈均一的悬浮液,加终浓度 0.02%的叠氮化钠 防止微生物生长。 8X Binding buffer:40 mmol/L 咪唑 , 4 mol/L NaCl, 160 mmol/L pH7.9 Tris-HCl ,最终 pH 调到7.9B实验设备分光光度计、水浴锅、 pH 计、 冰、 烧杯、 煮沸电炉、煮沸用的浮漂、移

3、液管、磁力搅拌器、超声破碎仪、高速离心机、离心管资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。4、 实验步骤 取前日分别在0h、2h 、4h 、6h 、8h 、10h所取的1mL样品及用适量1XBinding buffer悬浮的10h 发酵结束后的细胞(由100 ml发酵液离心来的细胞用4 ml 1X Binding buffer重悬 ) ,室温溶化后,用超声波破碎仪破碎细胞。1mL 样品的超声条件为: 50 Hz超声15s, 间隔10 秒 ,如此多次即可。用1XBinding buffer悬浮的细胞次数应该适当延长,当溶液变清即可停止。 破碎后的样品在1 g, 4离心20mi

4、n,弃沉淀。1mL的样品用来检测酶活性,用 1X Binding buffer 悬浮的细胞样品次日用于酶的纯化 , 此时放置于 -70 保存。 0h 、 1h 、 4h 、 6h 、 8h 、 9h 、 10h 时的样品中木聚糖酶活性的测定:记录好各个取样点时测得的数据 , 将其代入实验一所得标准曲线方程中后算出每 ml 发酵液的酶活性。注意 : 每个时刻的样品需做三次平行 , 所有平行样品应该一批次同时做完 , 以减小不同批次实验引起的误差 ; 酶液可能要适当经过稀释 , 以使最后读出的 A405 值在 0.1 1 之间 , 正式实验前应该做预实验摸索好稀释倍数。实验四、重组木聚糖酶的纯化1

5、 实验目的掌握 His-tag亲和层析柱纯化蛋白的方法2、 实验原理由xynB 基因编码的木聚糖酶有很高的热稳定性,在下保温2h,依然有9090%的活性 ,基于这一点 ,我们能够先用加热的方法除去酶液中的大部分不耐热的杂蛋白。蛋白质表面的某些氨基酸残基如:组氨酸的咪唑基团,半胱氨酸的巯基,色氨酸的吲哚基团 (后两种与金属离子的作用要小得多) ,可与金属离子亲和2+2+2+2+结合。用螯合剂能够将金属离子( Cu、 Zn、 Ni、 Co ) 螯合到母体。洗脱资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。如组氨酸标签 - 镍离子亲和柱子 ( His-tag) : 组氨酸是具有杂环

6、的氨基酸 , 每个组氨基酸含有一个咪唑基团 , 这个化学结构带有很多额外电子 , 对于带正电的化学物质有静电引力 , 亲和层析是利用这个原理来进行吸附的 , 亲和配体 ( 也就是填料 ) 上的阳离子 ( 一般是镍离子 ) 带正电对组氨酸有亲和作用。 洗脱的时候用高浓度的咪唑将蛋白洗下。组氨酸标签是原核表示载体上6 个组氨酸的区段。在xynB 基因编码的C端,我们引物的编码六个组氨酸的CAC 密码子 ,使得重组酶带上组氨酸标签。3、 实验材料和设备A. 试剂Ni-NTA 亲和层析介质 5ml8XBinding buffer:40 mmol/L 咪唑 , 4 mol/L NaCl, 160 mmo

7、l/L pH 7.9 Tris-HCl ,最终 pH调到7.94XElute buffer:4 mol/L 咪唑 , 2 mol/L NaCl, 80 mmol/L pH 7.9 Tris-HCl ,最终 pH 调到 7.98XCharge buffer:400 mmol/L NiSO 48XWash buffer: 480 mmol/L 咪唑 , 4 mol/L NaCl, 160 mmol/L pH 7.9 Tris-HCl ,最终 pH 调到7.94XStrip buffer:400 mmol/L EDTA, 2 mol/L NaCl, 80 mmol/L pH 7.9 Tris-HCl

8、 ,最终 pH 调到7.9B. 实验设备移液管、试管、分光光度计、 pH 计、 控温水浴锅、煮沸电炉、煮沸用的浮漂、铁架台资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。4、 实验步骤 热处理 :将样品装入洗干净的玻璃试管中,在 70水浴锅中保温30min,然后18000g 离心 4离心 30min 除去杂蛋白。 his-tag 亲和柱处理取 1mL Ni-NTA 亲和层析介质填料装柱 ( 根据说明书上填料的吸附能力和样品的多少使用适当体积的填料 ) , 接着用 3 倍柱体积的无菌水洗柱子 , 再用 5柱体积的 1X Charge buffer洗柱子 ,再用 3 柱体积的 1X

9、Binding buffer洗柱子。上样样品上样前 ,取出少量样品作为后面的SDS-PAGE实验用。把样品加入柱子,用 10 柱体积的 1X Binding buffer 洗柱子 , 接着用 6 柱体积的 1X Wash buffer洗柱子 ,然后用 6 柱体积的 1X Elute buffer洗脱柱子 ,此时注意用干净的EP管分部收集洗脱液。洗脱完后用1X Strip buffer洗柱子。 对上述收集的洗脱液测定木聚糖酶活,得到较高酶活的部分合并,并留出少量样品作为后面的SDS-PAGE实验用 ,余下样品在 -20 保存备用。实验五、纯化酶的电泳检测及比酶活测定1、 实验目的学会采用SDS-

10、PAGE(SDS聚-丙烯酰胺凝胶电泳 ) 分析基因工程产物和蛋白质的纯度鉴定及测定酶的比酶活2、 实验原理SDS-PAGE电泳是主要用来测定蛋白质分子量大小及纯度分析的技术。如果在 PAGE系统中加入十二烷基硫酸钠 (SDS), 则蛋白质的迁移率主要取决于其分子量的大小 , 而与蛋白质所带的电荷和形状无关。 SDS是阴离子去污剂 , 它能与蛋白质的疏水部分结合 , 并能把大多数的蛋白质分子拆分成亚基形式。 由于大多资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。数蛋白质与 SDS结合的摩尔比为 1.4: 1, 结合量很大 , 因此 , 加人 SDS增加了蛋白质表面的负电荷 , 屏

11、蔽了没有 SDS时正常存在的任何一种电荷。 SDS与蛋白质结合后 , 引起了蛋白质构象的变化 , 使得雪茄形状的蛋白质分子的轴比发生改变。在巯基乙醇的作用下 , 二硫键还原为巯基 , 不同蛋白质组成的短轴趋于一致 , 长轴与分子量成正比。 因此 , 它们的电泳速度不取决于电荷和形状 , 仅与蛋白质的分子量有关。当前较流行的 SDS-PAGE使用的都是线性垂直薄板状胶 , 这种胶是指在两层支持的玻璃板之间形成的薄片状凝胶。 由于薄片胶可在同一胶上跑很多样品 , 使聚合、 染色脱色具有一致性 , 因此薄片胶比管状胶的应用更广泛 , 本实验是按照 Bio-rad 的小凝胶系统来设计的 , 这些步骤也

12、适用于其它系统。经过亲和层析和加热纯化后 , 重组木聚糖酶应该在 SDS胶片上显示出一个单一的条带 , 分子量应该与预期的一样 , 为 40 kDa 左右。同一个酶在相同的测定条件下 , 如果比酶活越高 , 则表示该酶的纯度越大 , 本实验中的木聚糖酶经过了亲和层析和加热两步纯化后 , 比酶活应该逐渐升高 , 且经过亲和层析后和加热后的比酶活相差不大。3、 实验材料和设备A. 试剂丙烯酰胺 ( 电泳级 )双丙烯酰胺 ( N,N- 甲叉双丙烯酰胺 )Tris 碱SDS (十二烷基磺酸钠 ,分析纯 )TEMED过硫酸铵甘氨酸B. 工作液 :资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删

13、除。A 液 :丙烯酰胺储存液, 100ml30% (w/v)丙烯酰胺 , 0.8% (w/v)双丙烯酰胺注意 :未聚合的丙烯酰胺是一种皮肤刺激物和神经毒剂,操作时必须戴手套29.2 g 丙烯酰胺0.8 g双丙烯酰胺加蒸馏水溶至 100 ml,棕色瓶 4保存B 液 : 4 分离胶缓冲液 , 100ml75ml 2 mol/l Tris-HCl(pH 8.8)4ml 10% SDS21ml 蒸馏水可在 4存放数月C液 : 4 堆积胶 ( 浓缩胶 ) 缓冲液 , 100 ml50ml 1mol/l Tris-HCl(pH 6.8)4ml 10% SDS46ml 蒸馏水可在 4存放数月10%过硫酸铵

14、 5ml0.5 g 过硫酸铵5ml 蒸馏水可在密封的管内 , 4 存放数月电泳缓冲液 : 1L3g Tris碱14.4g 甘氨酸1g SDS资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。加蒸馏水至 1LpH 应该在 8.3 左右 ,在室温下长期保存5样品缓冲液 , 10ml0.6 ml 1mol/l Tris-HCl(pH 6.8)5ml 50%甘油2ml 10% SDS0.5ml 2- 巯基乙醇1ml 1% 溴酚蓝0.9ml的蒸馏水可在 -20 保存数月C. 实验设备蛋白质电泳装置 ( 垂直板蛋白电泳仪和电源)电源 ( 电压 200V, 电流 500mA)100沸水浴移液枪摇床1.5 mL 小所料管4、 实验步骤待检测的蛋白质分子量的大小决定了所使用的分离胶的浓度,下面为不同浓度的分离胶的分离范围 :丙烯酰胺在凝胶中的百分比分离胶的范围15%1545kDa12.5%15 60kDa10%1875kDa7.5%30120kDa