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1、行业背景,中国肿瘤发病率285.91/10万，每年新发病例321万，6人/分钟确诊恶性肿瘤。 肿瘤13标:中晚期蛋白标记物，PSA, CA125,CA199等。 影像学检测：CT，MRI, PET，仅检出5mm以上肿瘤。 病理诊断：穿刺样本检测，创伤性。 技术瓶颈：仅能检测中晚期肿瘤、难以早期诊断 ！ 液体活检：通过检测血液及其他体液中更加特异的肿瘤指纹来实现肿瘤早期诊断。 循环肿瘤细胞（CTC）：肿瘤上脱落的活细胞，可能代表了转移的种子； 循环肿瘤DNA（ctDNA）则是来自死细胞的遗传物质，通常以DNA短片段的形式存在。,循环肿瘤细胞，circulating tumor cell，CTC
2、1896年在患者外周血中发现与原发肿瘤细胞体积和形态相似的细胞 目前CTCs定义为自发或因诊疗操作脱离实体瘤原发灶或转移灶进入外周血循环的肿瘤细胞 在肿瘤转移灶形成前即可在外周血中检测到循环肿瘤细胞,肿瘤循环细胞的特性 稀有性：每ml血液约107个白细胞中仅有1个CTC 非典型形态：比血液细胞、正常组织细胞的体积大、细胞核大，不规则，核质比高、不容易发生形变 异质性：细胞表面抗原标志物表达差异、携带不同的分子信息、转移潜力差异 易聚集成团CTM：成瘤迁移能力是CTC的23-50倍 外周血细胞的遮蔽阻碍了它们的分离与分子鉴定，因此的检测是制约其临床应用的关键,循环肿瘤细胞的概念与特性,循环肿瘤细
3、胞的特性,CTCs可以是间质型、上皮型、上皮间质混合型、成团的CTCs(CTM),CTCs检测的临床可行性,临床意义,CTC 监测分析,耐药性检测 动态跟踪CTC数目，判断是否产生耐药性 肿瘤复发检测 CTC数目增多是肿瘤复发的前兆 肿瘤新药物的开发 配合研制新的抗肿瘤药物,体外早期诊断 肿瘤在1mm时，血液中可检测出CTC 预后判断 根据治疗前后CTC个数判断预后及存活时间 化疗药物的疗效评判 根据化疗前后CTC数目变化，确定药物是否有效,如何检测CTCs？ 由于外周血中CTC非常稀少，通常CTC检测会首先利用细胞的物理性质或生物特性等对CTC加以分离富集。 CTCs的富集：如何获取CTCs
4、？ 从红细胞和白细胞中富集恶性肿瘤细胞 CTCs的鉴定：如何鉴定所获细胞为CTCs？ 将恶性肿瘤细胞与红细胞、白细胞、正常上皮细胞、造血干细胞等区分开来,循环肿瘤细胞的检测,对于分离富集的CTC可以进行基因型或者表型分析等以计数CTC或者鉴定其分子特性 免疫表型分析： 靶细胞丢失 PCR分析： 高效率，高灵敏度，特异性，操作简单。 假阳性率较高、细胞形态学被破坏、需要更严格的标本保存条件和实验条件 单个CTC分子信息监测（克服白细胞污染）,循环肿瘤细胞的分析鉴定,循环肿瘤细胞的分离富集,CTCs分离、分型、分析,CTCs的检测方法及代表技术产品,免疫捕获法磁珠分选,原理： 将特异性抗原包被在已
5、有同源二抗的磁珠上制成免疫磁珠再与靶细胞上抗抗原结合成“靶细胞抗原抗体磁珠”复合物，在磁场作用下向一定方向移动，从而富集靶细胞. 分选策略 阳性富集：使用表面耦联抗目的细胞抗体的磁珠，细胞与磁珠结合后直接在磁场中被分离出来。 负性筛选：通过去除无关细胞使目的细胞得以纯化,阳性富集,CellsearchTM系统 CTC芯片（CTC-chip） MACSCell Separation 磁性细胞分选系统 原理： 采用抗EpCAM（CD326）结合免疫磁珠捕获EpCAM阳性CTCs 特点： 捕获的CTCs纯度较高 能够捕获到血液中上皮型、上皮间质混合型的CTCs 无法捕获到间质型CTCs（EpCAM阴
6、性）,magnet,Anti-EpCAM Coated ferrofluids,7.5ml,Anti-CK (epithelial cells) Anti-CD45 (WBCs) DAPI (viable cells ),Automated fluorescence detection system,使用抗EpCAM抗体抗体包被磁微粒，使其与肿瘤细胞结合，在特定磁场作用下达到分离CTC的目的。,阳性富集-CellsearchTM,CellsearchTM CTCs鉴定,上皮来源的CTCs的判定：DAPI（细胞核）阳性、角蛋白CKs阳性、CD45阴性,芯片的表层排布了78 000个包被抗 EpC
7、AM抗体的微位点 血液样本流经芯片时，抗体与肿瘤细胞结合粘附在芯片上 制造相对困难，成本昂贵， 显微位点周围的血流通畅性限制了与抗体覆盖位点接触的CTC数量,阳性富集- CTCs-Chip,原理： 联合上皮细胞标志及肿瘤特异性标志通过免疫磁珠分选特异性肿瘤的CTCs 联合抗MUC1和EpCAM抗体检测乳腺癌和直肠癌 通过RT-PCR扩增肿瘤标志物来鉴定CTCs 特点： 较单一使用EpCAM抗体更特异 不适用于EpCAM和CK阴性或弱化的CTCs PCR鉴定敏感性高，但易造成假阳性,阳性富集- Adna Test 检测系统,阴性富集,Cyttel/Cytelligen 检测系统 原理: 利用CD
8、45磁珠抗体吸附白细胞，在磁场作用 下去除白细胞，CTCs被富集沉淀 特点： 可检出EpCAM、CK阴性的间质型CTCs 样本处理步骤多，CTCs易丢失,阴性筛选法-Cyttel,步骤较多，CTCs容易丢失,鉴定不稳定,判定标准：DAPI阳性、CD45阴性，8号染色体扩增； 特异性不足,基于细胞大小过滤,原理：根据肿瘤细胞的体积大于白细胞体积分离CTC 代表技术：滤膜滤法分离上皮源肿瘤细胞（ISET） 方法：将全血经过带小孔8m的聚碳酸酯膜的过滤，即可除去白细胞 富集得到CTCs. 特点： 细胞完整性好； 可完全分离上皮型、间质型CTCs； 可检出循环肿瘤拴子； 局限：不宜检出细胞直径小于8m
9、的肿瘤 如神经内分泌瘤,HepG2 cells stained with anti-KL1,滤膜法,密度梯度离心,原理： 根据肿瘤细胞与白细胞密度不同，通过梯度离心分离CTCs OncoQuick分离体系 方法： 密度梯度离心后，白细胞通过多孔滤膜被滤除，而CTCs被富集在介 质层中，洗脱后得到CTCs. 特点：可分离CK阳性和阴性细胞 局限性： CTCs迁移可能至血浆层、红细胞层和粒细胞层而丢失； CTCs微栓子可能沉入红细胞层而丢失； 与肿瘤细胞特性、离心时间和温度等有关； 用血量多15-30ml,流式细胞术,原理： 根据白细胞表达CD45抗原、CK阳性CTCs表达EpCAM，采用不同荧光素标记的抗CD45和抗EpCAM，通过流式细胞术分析和分选CK阳性细胞的CTC（CD45- EpCAM+） 可在检测的同时进行细胞形态、DNA倍数分析 敏感性较低，需要的血液样本量大 缺乏规范的临床操作方法,常见CTCs一代检测技术的比较,