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1、生物材料,DNA,mRNA,一定大小范围DNA,PCR,cDNA（互补DNA）,反转录,基因组文库 cDNA文库,基因文库,包括,人工合成,限制酶切割,获取目的基因,构建表达载体,导入受体细胞,得到转基因生物,目的基因检测与鉴定,第一步,第二步,第三步,第四步,基因工程的基本操作程序,获取目的基因,生物材料,PCR,cDNA,mRNA,DNA,基因组文库,cDNA文库,一定大小范围DNA,人工合成,逆转录,限制酶切割,获取目的基因,构建表达载体,导入受体细胞,得到转基因生物,目的基因检测与鉴定,第一步,第二步,第三步,第四步,基因文库(gene library)概念,又称DNA文库，是指某个生
2、物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，通过筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体)，所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。 基因文库由外源DNA片段、载体和宿主细胞组成。,基因组文库(Genomic library),将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。该文库以DNA片段的形式贮存着该生物全部基因组的信息，可用于分离目的基因和保存某种生物的全部基因。,基因组文库,cDNA文库 (cDNA library),提取某生物组织或发育时期的总mRNA，经反
3、转录产生的cDNA (complementary DNA，互补DNA)片段分别与克隆载体重组，储存于受体菌中，该群体就称该生物基因组的cDNA文库。,结构基因,外显子,内含子,转录、加工修饰,mRNA,cDNA文库,反转录酶,cDNA,克隆、转化、培养、鉴定,构建基因文库的基本程序,1)提取研究对象基因组DNA，制备合适大小的DNA片段，或提取组织或器官的mRNA并反转录成cDNA； 2) DNA片段或cDNA片段与经特殊处理的载体连接形成重组DNA； 3)重组DNA转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌； 4)阳性重组菌落或噬菌斑的筛选。,基因组DNA文库,cDNA文库,基因组文库的类型,根据所
4、选用的载体可以分为： 质粒文库、噬菌体文库、人工染色体文库（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库）。,高等生物的基因组DNA十分复杂,单个基因在基因组或某个特定发育阶段或特定组织中所占比例很小。因此，要想从庞大的基因组中分离某个特定的未知基因非常困难，因此先把材料DNA分成若干易于处理的片段，然后确定目标序列在哪一片段，再进一步从该片段寻找目标序列，事情就变得容易了。,为什么要建基因文库？,从基因文库中筛选目的基因,1.通过克隆序列筛选：核酸杂交和PCR 2.通过表达产物筛选：免疫学检测（抗原抗体反应）,探针,探针是一小段带标记的单链DNA或者RNA片段（大约是20到500bp）， 用于检测
5、与其互补的核酸序列。 最初是使用带放射性的DNA探针，通过放射自显影来显示位置。后来又发明了免疫探针法，将探针核苷酸的侧链加以改造，探针杂交后，其侧链可被带有荧光标记的抗体所识别，从而显示出位置。,核酸杂交（菌落原位杂交法）,直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上,经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合,再与特异性DNA探针杂交,筛选出含有目的序列的菌落。,对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。,特点：,免疫筛选法（一）,放射性抗体检测法,滤膜（固定抗体）,+,免疫沉淀检测法,菌落,沉淀素,免疫筛选法（二）,PCR法获取目的基因,已知基因： 设计合成一对引物，直接从基因组
6、DNA中扩增该目的基因。 未知基因： 参照其他物种中该基因的两末端设计引物，从基因组DNA（或文库）中扩增该目的基因； 依照其他物种中该基因的保守区段序列设计引物，扩增出一段DNA，标记为探针，从基因组文库、cDNA文库中钓出该基因。 PCR法获取目的基因的前提是：要有足够制备合适引物的信息,PCR法获取目的基因优点,1.简便快速：在有足够引物信息的情况下，可直接从基因组DNA中克隆目的基因，大大减少了基因分离的工作量； 2.灵敏度高：可从极微量的模板扩增出目的片段； 3.对起始材料质量要求低：由于其灵敏度高和特异性强，极微量的材料或者混合的组织、部分已降解的DNA材料都可以作为起始材料；,化
7、学合成制备目的基因,如果蛋白分子较小，可根据氨基酸序列推导出其基因序列，采用人工合成的方法制备目的基因。化学合成法通常主要用于制备探针和引物。 磷酸二酯法 亚磷酸三酯法,获取目的基因的方法,一般来说： 目的基因的获得通常采用PCR法；化学合成法由于合成的片段较短，一般用于引物和探针的合成；基因文库一般用于保存基因资源。,目的基因检测与鉴定,通常采用分子杂交的方法。 分子杂交：采用已知标记的核酸分子或蛋白质分子检测混合样品中未知核酸分子或蛋白质分子。 根据其检测对象的不同可分为 Southern 杂交（DNA）、Northern 杂交（RNA）和 Western 杂交 （蛋白质）。,分子杂交的方
8、法,通常是采用各种方法将核酸（蛋白质）分子固定在固相支持物上，然后用放射性元素等标记的探针（抗体）与被固定的分子杂交，经显影（显色）后显示出目的核酸（蛋白质）分子。,Southern杂交(检测目的基因是否插入到受体细胞基因组中）,(1)提取 DNA，酶切，凝胶电泳分离各酶切片段，然后使DNA原位变性。 (2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。 (3) 预杂交滤膜，掩盖滤膜上非特异性位点。 (4) 让探针与同源DNA片段杂交，然后漂洗除去非特异性结合的探针。 (5) 通过显影检查目的DNA所在的位置。,提取分离受体细胞的mRNA,将mRNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素
9、滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。,Northern杂交(检测目的基因是否转录出了mRNA）,Northern杂交的过程,提取总RNA 分离mRNA：利用亲和层析的原理纯化mRNA。 制备目标RNA的探针：根据mRNA序列合成同源DNA探针，或以cDNA为探针。 Northern杂交：通过显影检查目的DNA所在的位置。,Southern杂交和Northern杂交过程示意图,Western杂交 （检测目的基因是否翻译成蛋白质）,中文一般称为蛋白质印迹技术。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳分离的细胞或生物组织蛋白样品进行检测。 Western Blot与Souther
10、n杂交或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。,Western杂交过程,经过SDS-PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜）上； 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应； 再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的目的蛋白。 根据检测结果，从而可得知被检细胞内目的蛋白表达与否、表达量及分子量等情况。,Western杂交结果图,常见载体容量,（二）细胞工程,动物细胞融合与单克隆抗体,细胞融合（cell fusion)，又称
11、体细胞杂交，是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜融合，形成单个细胞的过程。,细胞融合的常用方法,一、灭活病毒法： 二、聚乙二醇（PEG）法： 三、电融合法：,一、灭活病毒法,两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近； 通过病毒与细胞膜的作用使两个细胞膜互相渗透，胞质互相渗透； 两个细胞的细胞核互相融合，两个细胞融为一体； 进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。,二、聚乙二醇（PEG）法,PEG分子式：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，通常选用平均相对分子质量为10004000、浓度在30%50%的PEG进行动物细胞的诱导融合。 PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具
12、有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合.,PEG诱导融合的特点：其优点是融合成本低，不需特殊设备；融合子异核率较高；融合过程不受物种限制。其缺点是操作过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。,三、电融合法,细胞首先在交流电场中极化并沿电力线排列成串，形成细胞间的紧密接触；然后在高强度的直流电脉冲作用下，相互连接的细胞质膜被击穿而导致细胞融合。 电融合法的优点： 融合率高，重复性强，对细胞伤害小； 装置精巧，方法简单，可在显微镜下观察或录像观察融合过程； 免去PEG诱导后的洗涤过程，诱导过程可控性强。,融合细胞的筛选,细
13、胞融合后，会形成由未融合的亲本细胞、同核体以及异核体组成的细胞混合群体。可根据不同细胞生理生化特性的差异，设计具体的筛选方案和选择体系，优先选择杂交细胞或只允许杂交细胞生长，以淘汰亲本细胞。最常用方法是应用合适的选择培养基，使亲本细胞死亡，而仅让杂交细胞存活下来。,基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选 基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选 由温度敏感型细胞组成的杂种细胞的筛选 具有所需性状杂种细胞的筛选,常用的杂种细胞筛选方法,杂交瘤技术与单克隆抗体,抗体,由抗原刺激B淋巴细胞产生的，并能与刺激其产生的抗原发生特异性结合的、具有免疫功能的糖蛋白。,抗体结构,抗体是具有4条多肽链的对称结构，
14、其中2条较长、相对分子量较大的相同的重链(H链)；2条较短、相对分子量较小的相同的轻链(L链)。链间由二硫键和非共价键联结形成一个由4条多肽链构成的单体分子。整个抗体分子可分为恒定区和可变区两部分。,抗体的结构图,“Y”型，四肽链 重链 （5种: 、） 轻链 （2种: 、） 可变区 （V区） 超变区 骨架区 恒定区 （C区） 铰链区,抗体结构,在给定的物种中，不同抗体分子的恒定区都具有相同的或几乎相同的氨基酸序列。可变区位于“Y”的两臂末端。在可变区内有一小部分氨基酸残基变化特别强烈，这些区域称高变区。高变区的氨基酸序列决定了该抗体结合抗原的特异性。一个抗体分子上的两个抗原结合部位是相同的，位
15、于两臂末端，称抗原结合片段(antigen-binding fragment, Fab)。,抗体多样性的遗传学基础,抗体的L链是由C、V、J三个基因簇编码的，H链由C、V、D、J四个基因簇编码的。V编码可变区，有300个种类；D编码高变区,有15 20个种类；J编码连接V、C的结合区，有45个种类；C编码恒定区，仅有一种。这些外显子通过多种多样的随机组合重排所合成出的肽链，还要再进一步进行L和H链的随机组合，这样最后生成的抗体种类就非常多了。,抗原决定簇,抗原分子中存在的能与抗体Fab片段特异性结合的特殊化学基团，是免疫应答特异性的物质基础。,单克隆抗体,定义：由单一克隆B细胞杂交瘤产生的、只
16、识别抗原分子某一特定抗原决定簇的高度特异性的抗体。每种单克隆抗体其分子结构完全相同。,多克隆抗体,定义：抗原分子通常具有多个抗原决定簇，动物免疫后可刺激多种具有相应抗原受体的B细胞发生免疫应答，因而可产生多种针对不同抗原决定簇的抗体。这些由不同B细胞克隆产生的抗体称为多克隆抗体（polycolonal antibody, PcAb）。,单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞与经特定抗原免疫刺激的B淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术。,致敏B淋巴细胞的准备,用目的抗原免疫小鼠时，应选用纯
17、系、健康的8周龄BALBc小白鼠作为免疫动物，这样可以获得大量激活的淋巴细胞。 一般将各种病毒、细菌和癌细胞作为目的抗原接种动物制作抗原，其方法是将目的抗原进行腹腔或皮下注射，一般要进行初次免疫、二次免疫和加强免疫。加强免疫后45天，取脾脏分离B淋巴细胞备用。,骨髓瘤细胞选择,骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体 选择次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型（HGPRT-）或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）瘤细胞,细胞内DNA的合成途径,从头合成途径：以氨基酸和其他小分子起始合成核苷酸，进而合成DNA 的过程；可被叶酸类似物氨基蝶呤（A）阻断； 旁路合成途径：胸腺嘧啶脱氧核苷激酶（TK）利用胸腺嘧啶核苷（T
18、）合成DNA；次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）利用次黄嘌呤（H）合成DNA。,在旁路合成途径中，HGPRT负责催化磷酸核糖焦磷酸和嘌呤基形成嘌呤单磷酸核苷酸，而TK可催化胸苷转化为5-单磷酸胸苷，作为胸苷脱氧核苷酸合成的材料。,HAT选择培养基,含次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）的培养基，是动物杂交细胞筛选中最常用的方法。在这种培养基中细胞只能利用旁路途径合成DNA，因而只有具有HGPRT+或/和TK+的细胞才能生长。,在HAT选择培养基中,骨髓瘤瘤细胞（HGPRT-或TK-）及其同核体：不能增殖，死亡； B淋巴细胞及其同核体：体外培养条件下增殖次数有限， 死亡； 杂交瘤
19、细胞： 存活,阳性细胞的筛选,将融合细胞充分稀释，进行克隆培养；然后再通过酶联免疫吸附测定( ELISA) ，筛选出能够分泌较高水平抗体的融合细胞，即阳性细胞，再进行克隆化培养。,杂交瘤细胞的克隆培养,有限稀释法：将稀释到一定密度的杂交瘤细胞接种到96孔培养板中，尽可能使每个孔中只有一个细胞生长； 软琼脂培养法 ：软琼脂的半固态性质，使单个的杂交瘤细胞在相对固定的位置上增殖形成细胞克隆。,一般情况下，杂交瘤细胞的染色体处于不稳定状态，因此当细胞分裂时，染色体分配不平衡，易造成杂交瘤细胞在分裂增殖过程中失去抗体分泌能力，所以克隆化培养35次后，才能获得稳定基因型和稳定分泌特异性抗体的细胞。,单克
20、隆抗体的大量制备,体内法：将稳定的单克隆细胞注入到小鼠腹腔培养，然后从腹水中分离、提取单克隆抗体。 细胞培养：体外克隆培养，再从培养液中回收产生的抗体。,单克隆抗体的纯化,通过上述培养之后获得的培养液或腹水，其中除了单克隆抗体之外，还有无关的蛋白质等其他物质，因此必须对产品做分离纯化。目前，常用的方法有硫酸铵沉淀法、盐析法、离子交换、凝胶过滤或亲和层析等等。一般是综合采用几种方法分步进行纯化。,单克隆抗体的应用,1. 作为亲合层析的配体 单克隆抗体能与其相应的抗原特异性结合，因而能够从复杂系统中识别出单个成分。只要得到针对某一成分的单克隆抗体，利用它作为配体，固定在层析柱上，通过亲合层析，即可
21、从复杂的混和物中分离、纯化这一特定成分。如用抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)亲合层析柱，就可从孕妇尿中提取到纯的hCG。与其它提取方法(沉淀法、高效疏水色谱法等)相比，具有简便、快速、经济、产品活性高等优点。,2. 作为生物治疗的导向武器,将针对某一肿瘤抗原的单克隆抗体与化疗药物或放疗物质连接，利用单克隆抗体的导向作用，将化疗药物或放疗物质携带至靶器官，可直接杀伤靶细胞。 另外，将放射性标记物与单克隆抗体连接，注入患者体内可进行放射免疫显像，协助肿瘤的诊断。,治疗用脂质体,3.检验医学诊断试剂,单克隆抗体以其特异性强、纯度高、均一性好等优点，广泛应用于酶联免疫吸附试验、放射免疫分析、免疫组化和流式细胞仪等技术，目前，应用单克隆抗体制作的商品化试剂盒广泛应用于：病原微生物抗原、抗体的检测；肿瘤抗原的检测；免疫细胞及其亚群的检测；激素测定；细胞因子的测定。,4. 作为研究抗原的探针,例如前面讲的Western blotting。,5. 作为免疫抑制剂,抗人T淋巴细胞单抗(McAb)作为一种新型免疫抑制剂，已广泛应用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应。注射抗小鼠Thy-1抗原的单抗，可以抑制小鼠同种皮肤移植的排斥反应。此外，对用于同种骨髓移植的供体骨髓，在体外经抗T细胞单抗加补体处理，能减轻移植物抗宿主病的发生。,谢谢！,