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1、,1.HLA-B27抗原分子及其等位基因,HLA-B27抗原分子结构及其特点,HLA-B27抗原分子是由位于人类第六号染色 体短臂上B*27等位基因编码的糖蛋白, 分子量 为56103U。 由两条多肽链组成，一条为链或重链，分子 量约为44103U，包括胞外区，跨膜区，胞 内区三个结构域，其中胞外区又分为1，2， 3三个结构区；另一条为链或轻链即2微 球蛋白，分子量约12103U，二者结合共同 组成HLA-B27抗原分子。,HLA-B27抗原分子结构, 1区与2区的肽链折叠后共同构成一个抗原 结合凹槽，槽内形成A,B,C,D,E,F共6个袋状结 构，其中B袋在HLA-B27分子中是最保守的结构
2、。 凹槽的作用是结合抗原肽，使抗原肽与HLA-B27 分子牢固的结合。,HLA-B*27等位基因结构及其特点,2002年WHO正式命名的HLAB*27 等位基因达到了24个，其中只有15个 有相对应的抗原表达。到2009年11月 WHO正式命名HLAB*27等位基因 达到59个(B*2701一B*2759) 。 HLAB*27等位基因呈多态性，主要 是因为个别的碱基突变造成的，编码蛋 白的差异主要集中在l、2结构区内。,其中HLA-B*2701与HLA-B*2705编码的蛋白 在78-81范围内有2个氨基酸的不同； 其中HLA-B*2702与HLA-B*2705编码的蛋白 在78-81范围内有
3、3个氨基酸的不同； 其中HLA-B*2703与HLA-B*2705编码的蛋白 仅有1个氨基酸的差别，即在59位前者 为组氨酸（His），后者为酪氨酸（Tyr）；,HLA-B*2705基因分布最广，几乎见于所有人种。 甚至认为其它等位基因都是由HLA-B*2705基因发 生突变、移位形成的。 HLA-B*2705编码的蛋白最为显著的特点就是在B袋 上的45位发生氨基酸的突变，这一改变直接影响 HLA-B27分子在细胞表面的表达，影响HLA-B27分 子与抗原肽的结合，同时影响了HLA-B27分子对胞 内外抗原的递呈。,2.与HLA-B27相关的疾病,强直性脊柱炎 （ankylosing spon
4、dylitis AS） 幼年类风湿关节炎 （juvenile rheumatoid arthritis JRA) 急性前葡萄膜炎 (acute anterior uveitis，AAU) 白血病等疾病,强直性脊柱炎（AS）,1973年Brewerton和schiosstein发现 强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis AS）与HLA-B27抗原有 非常强的相关,这是目前唯一有临床 价值的血型相关抗原,这在迄今已知 的HLA与疾病的关联中是最强和最典 型的。,AS的抗原学检测,【HLA-B27与强直性脊柱炎的临床分析】报道：HLA-B27抗原阳性率在AS患者高达96以上，而
5、正常群体中仅4%-7%,HLA-B27抗原携带者发生AS的相对危险率高达70%。,与AS相关的B*27等位基因,AS的基因学检测,不同人群的AS患者涉及的B*27等位基因,与AS相关的B*27等位基因,不同人群AS患者中HLA-B*27等位基因频率 不同人群AS患者的HLA-B*27等位基因频率 摘自【HLAB*27高分辨等位基因在1 606例疑似强直性脊柱炎患者中的表达】,HLA-B27与AS致病机制的研究,HLA-B27分子与非折叠蛋白理论假说 HLA-B27分子游离重链与AS 其它,HLA-B27分子非折叠蛋白理论假说,HLA I类分子是在内质网成熟的，新合成的HLA I进入内质网腔 与
6、钙连蛋白结合，使I类分子在内质网中维持部分折叠，继而与新 合成的2-微球蛋白组装成完整的I类分子，此时B27分子才能被认 为是成熟的，转运至细胞表面。研究发现，HLA-B27折叠速度较其他 HLA分子（非HLA-B27分子）慢。导致内质网腔中出现大量的折叠不 良或部分折叠的HLA-B27重链部分，通常情况下，非折叠的重链在内 质网腔内能够被清除，但由于一些相关物质的缺乏或无效，所致非折 叠的重链堆积，形成了非折叠蛋白反应。有资料报道，AS的发生可能 与这些HLA-B27分子的未折叠有关。,HLA-B27分子游离重链与AS,HLA-B27分子的主要功能是：识别和处理抗原肽，然后在递呈给T淋巴细胞
7、。HLA-B27分子具有特殊的生物学效应，它在体外具有形成重链二聚体的能力，主要是通过B27分子第67位氨基酸的残基半氨酸的二硫键结合形成稳定的二聚体。通过认识HLA-B27分子结构的特异性，重要的是深入研究游离重链的表达是否应该认为是导致AS的发病原因之一。当HLA-B27分子适当的、正确的组装时，其递呈的抗原肽通常被CD8 CTL识别；但当AS发生时，限制性的CIM Th细胞却能识别非折叠、空载或缺失的B27分子。在这种情况下，就是HLA II类分子递呈B27重链，降解后形成的多肽被CD4 Th细胞识别后导致关节炎症。此研究目前还存在争议。,其它,HLA-B27可提高致关节炎的细菌在胞内的
8、存活率， 从而加剧关节炎的严重度。 B27改变信号转导学说，即HLA-B27通过修饰 炎症因子基因相关的信号转导过程而致关节炎。 HLA-B39,HLA-B60可能对AS的诱发起到一定的作用。,幼年类风湿性关节炎（JRA）,幼年类风湿性关节炎（juvenile rheumatoid arthritis JRA)是类风湿性关节炎疾病中的一个特殊类型，而HLA-B27抗原阳性的幼年类风湿关节炎又是类风湿关节炎疾病中的一个亚型。幼年类风湿性关节炎是儿童时期较常见的结缔组织病，国外的报道发现，较多的幼年类风湿性关节炎患者的HLA-B27抗原呈现阳性，且没有男女性别差异。,【differential d
9、iagnosis juvenile ankylosing spondylitis and juvebile rheumatoid arthritis by subtypes of HLA-B27 alleles】报道：和该疾病相关 的HLA-B*27的等位基因涉及B*2705,B*2704, B*2707,B*2702基因。在HLA-B27抗原阳性的 JRA患者中，B*2705基因占60.7%，B*2704基 因占28.57%，B*2702基因占3.57%，B*2707 基因占7.14%。,HLA-B27与JRA致病机制的研究,以各种感染性微生物作为外来抗原（HLA-B27分子与其结构有相似性
10、），激活免疫细胞，通过损伤或分泌细胞因子触发异常的免疫反应，引起自身组织的损害和变性。 特别是细菌、病毒的特殊成分作为超抗原，其结构与人类MHC抗原有同源性，不需抗原呈递细胞加工处理，即可直接与T细胞受体直接结合（HLA-B27充当细胞表面受体），激活T细胞。,急性前葡萄膜炎（AAU),急性前葡萄膜炎(acute anterior uveitis，AAU)是一类常见的自身免疫性致盲眼病 ，病因复杂、病程长、易反复发作,要确定其发病原因仍比较困难。自1973年Brewerton DA等人首次报道HLAB27抗原与AAU之间的相关性以来，迄今为止，已发现2O多种眼病与HLA抗原具有相关性 ，其中最
11、主要的是HLAB27抗原与AAU之间的相关性。,【Association between HLA-B27 antigen and acute anterior uveitis】指出：国内外报道有所不同，国内报道37.0-60 AAU患者HLA-B27抗原呈阳性，国外报道19-88呈阳性,而B*27等位基因与AAU的关系报道较少。 【acute anterior uveitis and HLA-B27】报道，在HLA-B27抗原阳性的AAU患者中,HLA-B*2704基因占447%, B*2705基因占56%。,HLA-B27与AAU致病机制的研究,葡萄膜炎-受体假说：HLAB27(+)的AAU
12、可能 由于HLAB27分子担当细胞表面受体，其与微 生物结合，由此引起葡萄膜炎。 分子拟态假说:HLAB27分子在结构上与激发 引起AAU的微生物肽序列相似,从而引发葡萄膜炎。,其它疾病,【Genetic markers linked to rheumatoid arthritis are also strongly associated with articular manifestations in ulcerative colitis patients】 【Flt3一ITD mutations can generate leukaemia specific neoepitopes： po
13、tential role for immunotherapeutic approaches】 【Ankylosing spondylitis is linked to Klebsiellathe evidence】 等三篇文献报道：HLA-B27抗原与白塞氏病也有一定的相关性。,此外，HLA-B27抗原与白血病、心脏疾病、鼻咽癌、银屑病、关节炎型肠炎也有相关性，但相关报道较少 。,3.HLA-B27的检测方法,微量淋巴细胞毒实验（CDC） 流式细胞术（FCM） 分子生物学技术（PCR）,三种检测方法的对比,HLA-B27基因分型检测方法,特异性引物序列聚合酶链反应 (PCR-SSP) 序列特异
14、性寡核苷酸-聚合酶链反应（PCR-SSO） 聚合酶链反应-直接测序分型（PCR-SBT）,PCR-SSP:针对HLA-B*27基因的外显子2的序列， 合成相应的HLA-B*27基因引物，在 PCR扩增仪上扩增即可，这种特异性 的PCR扩增产物可通过琼脂糖凝胶电 泳检出，凝胶成像系统下观察结果。,血清学检测HLA-B27抗原的优缺点,实验操作方面（1）经典的血清学分型技术因其操作简便，准确率 尚可且成本较低，曾得到广泛应用。 （2）所用标本须为新鲜血液标本。 （3）受细胞纯度、补体差异、单抗效价的影响， 易出现错判漏判，观察结果存在主观因素 。 临床应用方面：血清学检测的是蛋白抗原，不能检测出H
15、LA-B*27 等位基因，即血清学结果是阴性，只能说明HLA- B27抗原阴性，并不能确定HLA-B*27基因是否存在。 目前尚无针对HLA-B*27不同等位基因的抗体，故不 能检测出对应的HLA-B*27等位基因.,基因学方法检测HLAB*27基因的优缺点（以PCR-SSP为例）：,实验操作方面（1）只需PCR扩增仪和琼脂糖凝胶电泳设备；费用中等， 适合在我国现有条件下开展。 （2）标本需要量少，取材容易，提取的DNA可长期保存； 陈旧血、冷冻血也可用于DNA的提取，使留取标本不 受时间的限制。 （3）结果准确可靠，分析结果客观，根据内对照及有无特 异性区带来判断结果一目了然。 （4）PCR
16、时要在严格的实验条件下进行，防止污染。 临床应用方面：能直接检测出HLA-B*27的等位基因，且不同的等位基因 与疾病的相关性大相径庭，不同等位基因导致的临床表现 各不相同，适于临床常规；,检测结果不正确主要的危害在于： 检测结果假阴性：使很多病人在鉴别诊断上缺乏依据； 检测结果假阳性：使一些病人误用治疗类风湿和强直 性脊椎炎的药物。 HLA-B27高分辨试剂盒能简单、快捷的检测出HLA-B*27等位基因，有效地避免了血清学检测结果的假阴性造成疾病诊断的漏诊；同时也能有效地避免了检测结果的假阳性，造成疾病诊断的误诊；同时，直接检测出的HLA-B*27等位基因与疾病的相关性各不相同，能有效的指导
17、临床疾病的诊断。,4.本公司的HLA-B27试剂盒,HLA-B*27筛查试剂盒 HLA-B*27验证试剂盒 HLA-B*27高分辨试剂盒,本公司研制的HLA-B*27基因高分辨引物板试剂盒，采用PCR-SSP方法检测HLA-B*27等位基因，能直接检测出中国人常见的HLAB*2704、2705、2702、2706、2701、2708、2710等基因，用于AS和其它相关疾病的辅助诊断。,标本要求：标本需要量少（只需6ulDNA即可，DNA最佳浓度 为30-50ng/l，且A260/A280值为（1.8-2.0）， 新鲜血、陈旧血、冷冻血均可。 提取的DNA可于 -200C长期保存。 实验时间：全
18、部PCR循环不超过1.5小时 ，整个实验在2 小时左右完成。 所需仪器：PCR扩增仪,凝胶成像系统（紫外灯也可),电泳 设备,离心机等。 实验室要求：PCR临床应用实验室必须要符合中国国家PCR 实验室技术规范要求,操作步骤： （1）配制反应体系： 每人份用量：60l dNTP-Buffer工作液 + 0.5l Taq酶（5 units/l）+6l DNA （2）进行PCR扩增 （3）在2.5%琼脂糖凝胶中，140-150V电泳15-20分钟 （4）观察结果,结果解释： 阳性孔：有两条带，一条是内参带（865bp），另一 条是特异性扩增带。 阴性孔：只有一条带，是内参带（865bp），无特异 性扩增带。 配有相应的判读软件来分析结果。,HLA-B*27高分读板纸,下图为HLA-B*2704等位基因的电泳胶图 下图为HLA-B*2705等位基因的电泳胶图,Thanks,