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1、概述,有些目标产物不在发酵液中，而是存在于生物体中。尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质不会被分泌到发酵液中，而是在细胞内沉积，使胞内产物释放出来一般需要破碎细胞壁 。,分 类,本节主要研究的是革兰氏阴性原核生物。 其细胞结构中没有细胞核：基因物质位于单链DNA上。典型的生物是大肠杆菌，是生物技术研究的主体。通过这种细胞生产了很多细胞重组的产物。,细胞膜,Gram-negative procaryotes 革兰氏阴性原核生物（E.coli）,革兰氏阴性细胞结构有三层：最外层约8mm厚，酶大多数镶嵌在这层膜上。革兰氏阳性原核生物缺少最外层结构， 但有第二层肽聚糖层和胞浆空间。 第三层为浆膜层或内
2、膜层，革兰氏阴性菌和革兰氏阳性都有这一结构，该层主要由磷脂组成，还有分散的蛋白质分子和金属离子。,这三层有不同功能。外层及肽聚糖层使细胞有一定的机械强度；破坏该层是本章讨论的重点。浆膜层和细胞内膜控制细胞的渗透压，即将营养物质运送到细胞内，将代谢物排出胞外。,真核细胞，具有真正的细胞核，其结构要比原核生物复杂的多，以图所示的酵母菌为例，和原核细胞一样，真核细胞也具有一层细胞膜。,动物细胞,植物细胞模式图,破壁难易程度 与壁强度、壁厚度、聚合物的种类、 细胞的形状和大小有关 细菌比真菌易破碎 G+用溶菌酶 G-添加EDTA，除去Ca2+,细胞破碎理论,1)、细胞破碎 A 压撞 B 剪切 C渗透
3、冻胀 D 破壁破膜 2)、产物释放,一、机械法,高速珠磨机 珠直径、数量、悬浮液浓度、搅拌速度,珠磨法,WSK卧式高效全能珠磨机,Crushing in ball mill 珠磨法,ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机,高压匀浆器,影响因素,操作压力p：p, R 。温度 2C /10MPa 。 破碎次数N：N，R 。 温度：比速度k与温度有关，温度25C，k1.5倍。 细胞种类：如大肠杆菌比酵母易破碎,超声波破碎(1525kHz) 机理 在超声作用下产生的空穴化作用(cavitation)，空穴的形成和闭合产生极大的冲击波和剪切力。 发声器和换能器 高频电流 机械振动 功率、工作时间（9S）、间歇时间
4、、工作次数、 产热大、实验室,Ultrasonication 超声波,超声波破碎仪,超声破碎法,超声破碎法,优点：适合于多种细胞的破碎 缺点：A、影响因素多，如振幅、黏度、表面张力、液体体积和流速、探头材料和形状；B、有效能量的利用率低；C、产热大，需控温； D、不易放大，仅应用于实验室规模的细胞破碎。,JJ-2组织捣碎匀浆机,研钵,机械法,优点 A、在大规模cell破碎中，高压匀浆机和珠磨机用得最多; B、高压匀浆机最适合于酵母和细菌; C、珠磨机可用于酵母和细菌，但对真菌菌丝和藻类更合适.,二、非机械法,化学法,Osmotic Shock(渗透冲击法),最简单的是渗透冲击法。 此法将一定体
5、积的细胞液加到2倍体积的水中，细胞中溶质浓度高，水不断进入细胞，使细胞膨胀，最后导致破裂，释放胞内物。,细胞破碎的难易决定于其类型，红血球细胞容易溶破，动物细胞只有当其组织被机械切碎或匀浆后才易溶破。植物细胞很难溶破，因为植物细胞中含有大量的木质成分，通过渗透流很难渗透。,渗透流的动力来自渗透压，渗透压可以通过化学平衡来估算： P=RTC 该式称为范特苛夫定律。 许多细胞内溶质浓度大约为0.1M NaCl 或0.2M溶质 。,例：一种耐盐细胞其能积累细胞内低分子量卤化物，适应高渗透压，能在含有0.32mol/LNaCl, 0.02mol/LMgCl2 , 0.015mol/LCaCl2, 0.
6、01mol/LFeCl3 的培养基中培养，当其从含盐量高的培养基中转移至清水中，在数分钟内能将胞内产物释放出来，试估计细胞膜所受渗透压的大小。（设操作温度为25）,解：细胞所受渗透压按照下式计算： P RTC 8.314298(0.3220.0230.01530.014)103 1.94106 Pa,酶解法 阳性菌：溶菌酶，分解糖苷键，低渗溶液破裂 阴性菌：EDTA-溶菌酶、甘氨酸-溶菌酶、 青霉素法（抑制细胞壁合成） 酵母菌：蜗牛酶、纤维素酶 霉菌：几丁质酶、壳聚糖酶 自溶作用：加热、干燥诱发,冻-融法 细胞 -15冷冻、室温融化 细胞膜疏水键破裂，胞内水结晶膨胀破裂 温和、破碎率低,干燥法
7、 细胞膜渗透性改变，易抽提（丙酮、丁醇） 空气干燥（酵母）25-30热空气 真空干燥（细菌） 喷雾、冷冻干燥（不稳定生化物质）,非机械法,优点： A、产品释放的选择性； B、提取速度和收效高； C、产品的破坏小； D、对外界环境，如pH和温度等要求低。,机械法和非机械法的比较,机械破碎法缺点： A、高能、高温、高噪音、高剪切力(四高)，易使产品变性失活； B、非专一性，胞内产物均释放，分离纯化困难； C、细胞碎片大小不一，难分离。 非机械破碎法缺点： A、引起新的污染，尤其是其他化学方法； B、一般只有有限的破碎，常需与其他物理法连用。,细胞破碎的评价,破碎率定义 N0：原细胞数，N：破碎后残
8、存的正常细胞。N0和N的可通过直接计数和间接计数法得到。 直接计数法 方法：样本稀释 - 染色 - 上样 计数。 计算：同上。 优点：方法简单。 缺点： A、计数时间长 B、细胞聚集时，不利计数 C、染色误差。,细胞破碎的评价,间接计数法 方法：样本离心 - 取上清液 - 测特定蛋白质或酶 - 与理论的最大值比较。(紫球藻细胞 藻红蛋白) 计算：Y(%)=100(R/ Rm) Rm：理论最大值，R：实验测得值。 优点：A、方法客观可靠，尤其对蛋白质和酶，B、有多种选择的指标，胞内位置(如胞膜、胞壁、近胞膜蛋白等)，灵活性大。 缺点：影响因素多，如温度、pH值、剪切力、溶液的稀释等。 解决办法：
9、筛选相对稳定和恒定的指标。,基因工程表达产物,存在的问题 A、包含体 B、N-端多一个蛋氨酸残基、表达产物未糖基化（大肠杆菌） C、表达产物过度糖基化，目标产物变成抗原（酵母） D、大肠杆菌的内毒素 包含体（一般步骤） A、包含体的分离 B、包含体溶解、变性、还原，一般用尿素、盐酸胍、SDS C、变形蛋白质的复性 D、一般的分离纯化,基因工程表达产物,例：人-干扰素的后处理工艺 发酵液 离心(发酵液冷却至10C以下，4000r/min离心10min) 菌体 细胞破碎(1倍体积细胞+10倍体积 buffer, 冰浴超声破碎5次, 30s/次, 4000r/min离心30min)，洗涤(0.1%
10、Triton X-100溶液，1000r/min离心20min，重复三次) 包含体 提取变性(包含体+8M 尿素 pH 8.0 50mM Tris-HCl buffer 0.2 mM EDTA, 10mM DTT室温搅拌2h, 离心(15000r/min, 30min) DTT二硫苏糖醇 用于蛋白质二硫键的裂解,基因工程表达产物,变性液 稀释(取1份变形液+99份上述buffer(不含DTT)，使尿素浓度小于0.1M，4C下搅拌24h） 复性液 浓缩(用截留10000D的超滤器浓缩100倍)，透析后离心(15000r/min离心30min) 浓缩上清液 Sephacryl s-200柱层析分离 层析柱2100cm，pH 8.0 50mM Tris-HCl buffer 平衡洗脱 收集主峰、冻干、终产物 (纯度可达100%，DNA及热源合格),