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1、内 容,第一节 病毒感染的诊断(检查方法） 第二节 病毒感染的特异性预防(自学） 第三节 病毒感染的治疗（自学）,第一节 病毒感染的诊断 （Diagnosis of viral infection）, 标本采集与送检原则 病毒感染的检查方法,一、标本采集与送检原则, 按疾病种类与病程采取不同标本 在发病早期与用药之前采取标本 无菌操作，有菌标本用“双抗”（青、链霉素）或 “三抗”（青、链霉素+两性霉素B）处理 冷藏速送，病变组织用50甘油保存 血清学检测：IgM 单份血清 IgG 双份血清,二、检查方法, 病毒的形态学检查 病毒的血清学检查 病毒的分子生物学检查 病毒的分离培养与鉴定,快速诊断
2、,1. 病毒形态学检查,电子显微镜：可观察各种病毒的形态 但设备贵、操作复杂，应用受限 光学显微镜：可观察大病毒（痘病毒）和包涵体 对一般病毒检测意义不大,呼肠病毒感染回肠上皮细胞电镜照片,Electronmicrographs,Inclusion body,Cytomegalic cell that contains a dense, “owls eye,“ acidophilic intranuclear inclusion body,Negry body,2. 病毒血清学检查, 已知抗原测抗体（诊断） 已知抗体测抗原（鉴定病毒属、种、 型、亚型）,(1) 中和试验(Neutralizat
3、ion test) (2) 血凝抑制试验(Hemagglutination inhibition test) (3) 补体结合试验(Complement fixation test) (4) 免疫标记法(FIA、EIA、RIA) (5) 蛋白印迹(Western blot),2. 病毒血清学检查,方法：,3. 病毒分子生物学检查, 核酸电泳(nucleic acid electrophoresis) 核酸杂交(nucleic acid hybridization) 核酸扩增(PCR） 基因芯片(gene chip) 基因测序(gene sequence),方法：,4. 病毒的分离培养与鉴定,:
4、, 病毒的分离培养 病毒的鉴定 病毒数量及感染性测定,病毒的分离培养方法：, 动物接种 鸡胚培养 细胞培养, 动物接种(animal inoculation),动物：鼠、兔、猴、黑猩猩等 优点：结果易观察，可建立动物模型 缺点：有饲养条件要求，费用高、动物 体内常带有潜伏病毒。 目前已很少应用。, 鸡胚培养(embryonated egg culture),受精卵,孵育9-14天,鸡胚,接种病毒,孵育2-7天,收获相应的材料进行鉴定,鸡胚接种部位：,优点： 易管理 不带微生物 成本较低 缺点： 操作程序复杂 目前用鸡胚培养的病毒主要是流感病毒, 鸡胚培养(embryonated egg cul
5、ture),(3) 细胞培养 (cell culture),根据细胞生长的方式分: 单层细胞培养（monolayer cell culture） 悬浮细胞培养（suspended cell culture）,根据细胞来源、染色体特征及传代次数分: 原代培养细胞 二倍体细胞株 传代细胞系或株,(3) 细胞培养 (cell culture),原代培养细胞（primary cultural cells),组织 组织块 分散的单个细胞 单层细胞,剪碎 蛋白酶,(原代细胞),单层细胞,(次代细胞),传代培养,培养基,原代培养细胞（primary cultural cells),特点: 对多种病毒敏感 生
6、长能力有限,获取成本高 可携带潜伏病毒 应用: 病毒分离与鉴定 病毒学实验研究 不能用于制备疫苗,epithelial cells,体外分裂50100代仍保持二倍染色体数目的单层细胞,特点: 对多种病毒敏感 不带异种蛋白(人源性) 不带病毒,无致瘤潜能 应用: 病毒分离与鉴定 病毒学实验研究 制备疫苗,二倍体细胞株 (diploid cell strain),fibroblastic cells,传代细胞系 (continuous cell line ),特点: 对多种病毒敏感性高 繁殖能力强,传代时间长 有致癌危险(来源于癌细胞或突变的二倍体细胞株) 应用: 病毒分离与鉴定 病毒学实验研究
7、不能用于制备疫苗,能在体外无限传代的细胞系。如 HeLa, Hep-2,epithelioid cells,4. 病毒的分离培养与鉴定,:, 病毒的分离培养 病毒的鉴定 病毒数量及感染性测定,病毒鉴定：, 病毒在细胞中增殖的指标 病毒形态学鉴定 病毒抗原鉴定 病毒基因鉴定, 细胞病变效应 (cytopathic effect, CPE),病毒在敏感细胞内增殖引起的光镜下可见的细胞病理改变。,CPE：病毒感染细胞发生形态改变,Syncytium formation in cell culture caused by RSV (top), and measles virus (bottom).,C
8、PE：病毒感染细 胞与邻近细胞融合,CPE：形成包涵体（inclusion body）,(核内) (胞浆内),Syncytial formation caused by mumps virus and haemadsorption of erythrocytes onto the surface of the cell sheet., 红细胞吸附（hemadsorption, HAd）,受染细胞膜表面血凝素（HA） RBC表面HA受体, 干扰现象（interference）,风疹病毒人胚肾细胞 病毒增殖，CPE（）,埃可病毒人胚肾细胞 病毒增殖，CPE（）,人胚肾细胞,风疹病毒？ 埃可病毒,C
9、PE(-)埃可病毒(-) 风疹病毒(+) CPE(+)埃可病毒(+) 风疹病毒(-), 细胞代谢的改变,病毒 感染细胞 在细胞内增值 细胞代谢减慢 培养液pH值变化减慢,4. 病毒的分离培养与鉴定,:, 病毒的分离培养 病毒的鉴定 病毒数量及感染性测定,病毒数量及感染性测定：,蚀(空)斑形成试验 50%组织细胞感染量,病毒总量(活病毒+死病毒)： 感染性病毒量:,血凝试验,蚀(空)斑形成试验（plaque assay）,原理：将适当稀释浓度的病毒液定量接种于敏感的单层细胞，经一段时间吸附后，在细胞上覆盖一层未凝固琼脂，待其凝固后继续培养，由于病毒的增值使感染的单层细胞病变脱落，形成肉眼可见的空
10、斑，一个蚀斑是由一个感染性病毒颗粒增殖而形成的，计数平板中空斑数可计算出样品中活病毒的数量。 通常以每毫升病毒液的空斑形成单位（plaque forming unit, PFU),既 PFU/ml表示。,PLAQUE ASSAY,PLAQUE ASSAY,蚀(空)斑形成试验（plaque assay）,Vero cells, which grew confluently on the bottom of the plastic plate (1.5 cm diameter), were infected with herpes simplex virus,用途： 测定感染性病毒量 单位: PF
11、U (plaque forming unit)/ml 由一个感染性病毒颗粒增殖而形成的一 个空斑称为空斑形成单位。 分纯病毒,蚀(空)斑形成试验（plaque assay）,50%组织细胞感染量 (50% tissue culture infectious dose, TCID50),概念: 测定病毒感染细胞后引起50%细胞病变或 死亡的最小病毒量。 方法: 将待测病毒液作10倍系列稀释，分别接种于 单层细胞，经培养后观察CPE等指标，以能使50%细 胞感染的病毒最高稀释度作为终点。用统计方法计 算出50%组织细胞感染量。 用途: 判断病毒的感染性和毒力,1.名词解释: cytopathic effect（CPE） plaque assay TCID50 2.分离病毒标本和血清学诊断标本各有何求？ 3.常用分离培养病毒的方法有哪些？ 4.病毒在组织细胞中增殖的指标是什么？,思考题,