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1、神经细胞体外培养的历史神经细胞体外培养的历史 n神经组织的体外培养方法是由Harrison，于1907年首 创的。 n由于该方法具有简化细胞生化环境、明确生长条件、 便于施加实验因素及容易获得活体直接观测结果等优 点，因而已成为研究神经系统结构和功能的有效手段 。 n九十余年来，这项技术已从组织块（或植块）培养（ explant culture）发展到分离细胞培养 (dissociated cell culture)，并逐渐与多种现代技 术结合起来，在神经科学各领域发挥了重大作用。 n 组织块培养分离细胞培养 甚至单一型细胞培养 神经组织的植块培养法 n悬滴培养方法 n单盖玻方法 n双盖玻方法
2、 1925 n改良双盖玻方法 n培养物： CNS灰质、白质、外周神经节或神经小段 突起 非神经元外伸 优点 n 所需培养液量少，可反应组织代谢中 微量生化改变 n 保留了植块内组织特征 不足 n 培养空间小，O2 CO2供少 n 培养空间湿度难以控制，水分会蒸发 n 密封手续繁杂，不利更换培养液，难 以观察单个神经元生长。 神经元的分离细胞培养方法 1956年，Nakai首创了神经组织的分离培养方法 材料来源：胚胎动物神经组织 n神经元增殖发生于胚胎期 n形态学分化和化学分化程度低，体外存活强， 成熟后则相反，且神经元会受到大的普遍损伤 。 部位：部位：灰质、PNS神经节，神经元集中，密度大
3、神经元的体外培养液 n 天然合成成分 血清 血浆 胚胎撮液 n 人工培养基 n 无血清培养基 化学限定性培养基 n 常用的：DMEM + 添加剂 F12 葡萄糖 为神经元能量代谢主要来源 33mm CO2 NaHCO3缓冲系统重要 HEPESO2耗量更 高 K+ 神经元生理活动的重要离子，K+是神 经元存活所必需的，K+ 24.5mM 能提高 神经元存活，促分化 非神经元成分的抑制 有 2-3天 神经元无血清限定培养液 人工合成的培养基虽然具备了细胞生长的基本 营养物质和无机盐类，但仍无法满足不同类型 细胞的特殊需要。大多数神经元在基础培养液 中即使能够存活也为期不长，更难以分裂。因 此可根据
4、神经元的特性，给基础培养中再添加 某些特殊物质。 选择添加剂的基本过程 n 限定连续细胞系的体外生长条件。 n 试定该细胞系来源的细胞的培养 液条件。 Bottenstein实验室经过长期研究发 现如下添加剂比较好 人转铁蛋白、牛胰岛素、硒酸钠、孕酮、腐胺 加入到F12与DMEM 1:1混液中，可以代替血清 添加物，用来培养大鼠CNS的成神经细胞瘤细 胞。删去其中任何一种添加物都可导致成神经 细胞瘤细胞生长状况锐减。该实验室共列出了 三种神经元限定性培养添加物的配方，代号分 别为N1、N2、N3。 N1的配方为 n 胰岛素5g/ml n 转铁蛋白5g/ml n 孕酮20 nM n 腐胺100U
5、m n 硒30nM 神经体外培养的生长基质 n胶 元 n 多聚赖氨酸 n LN 神经细胞培养操作程序表神经细胞培养操作程序表 脊髓后根节 大脑皮质 孕1820天大鼠胚胎 新生13天大鼠 在CMF-Hanks液中取出组织除去脑膜 与CMF-Hanks 液一起移至离心管 舍弃CMF-Hanks液，再加入5ml 0.25%胰蛋白酶和5滴0.2%Dnase液 370C，30min 舍弃胰蛋白酶，加入5ml培养液和10滴Dnase液 用巴斯德吸管吹打20次，再用套有微量加样器头的加样器吹打20次 若有组织残渣，将上清移至新试管再加3ml培养液反复吹打 将细胞悬液收集于离心管，离心1200r/min ，8
6、min，舍去上清，向沉 淀加培养液，离心1200r/min，8min 加入培养液调整悬液中的细胞浓度，神经节细胞为1107 种入涂有poly-D-lysine的盖片上，每片50l 放入CO2孵箱中过夜 次日加3ml培养液 2天后（培养的第三天）换入有DNA合成阴断剂的培养液 神经元的分离培养过程 大鼠大脑皮层神经组织细胞培养 组织来源 n新生大鼠1-2日龄，碘 酒 ，洒精消毒。 n 断头，取出大脑，分离脑 膜 ，夹取两侧大脑皮质放 入接种培养液中，用D-Hanks冲洗二遍。 n剪碎，0.5-1mm3,用D-Hanks充分洗去残血 n加入5-10倍量0.25%胰蛋白酶，移入离心管中放到水 370
7、C浴箱中消化20-25分钟。 n终止消化离心洗涤 2000转/分 ，5分钟弃上清。吹打 制成细胞悬液。 n台盼兰染色计数后接种于事先涂好鼠尾胶的24孔板中 。 n370C 5%CO2培养2天后换生长培养液 大鼠海马神经细胞培养方法 神经元体外生长特征 接种密度与体外存活率 n 当96孔 每孔2000-3000个 或 7000-10000个/cm2 几乎无神经元存活 n 当8000-12000个/96孔 或 2.8万-4万个/cm2 存 活率最大。 n3天后不到接种的一半，故研究某一生长因子 前3天加药最好 神经元的体外存活时间 n 短1-2W n 长 4个月 体外分化标志 n 破伤风毒素 n
8、NSE n NF200,NF160 神经细胞的特殊染色鉴定方法 n 尼氏体染色 焦油紫 甲苯胺蓝 硫瑾等组化染色 n 镀银染色 n NADPH-d特异性神经组织化学法 神经细胞培养的应用神经细胞培养的应用 应用领域应用领域 研究各种因素对神经的影响研究各种因素对神经的影响 1. 化学物质，物理因素，生物因素，环境中化学因子， 自由基，外伤、高温等因素，病毒感染。 2. 药物，细胞因子，对神经细胞的作用，各种药物，如 中药，脑活素，神经生长因子，成纤维细胞生长因子 （bFGF），神经营养因子 3. 细胞间相互作用：巨噬细胞，雪旺细胞等。 4. 各种生理病理状态下神经元状态改变 实验方法实验方法
9、研究手段及测量指标 1. 形态学观察： 光镜，相差显微镜：细胞数目，形态，大体结构，突触 电镜：超微结构。 2. 激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope, LCSM) ：研究细胞内成分变化，离子改变 等，三维重建 3. 膜片钳技术，细胞表面通道和离子流动，电变化。 研究手段及测量指标 4. 聚丙烯酰胺凝胶电泳：细胞内蛋白，核酸变化 5. 染色：苏木素-伊红（HE）染色及尼氏（Nissl) 染色，免疫组化染色。 6. 显微测量：胞体平均直径和胞体椭圆率，突起 长度及胞径。 7. 荧光光度分析仪：MTT法测定细胞的OD值 培养神经细胞的观察和鉴定
10、培养神经细胞的观察和鉴定 1. 神经细胞培养存活的标志：种植24小时后贴 壁，渐长出几十微米的突起，神经细胞大多都 能存活。 2. 特殊培养阶段：培养的9到12天之间，有较多 神经元死亡，以后存活下的细胞突起长而多， 互相形成网络，电镜下可见突触。 3. 形态学观察：神经细胞胞体大，饱满，核大 ，有立体感，折光性强，周围有一圈光晕，轴 突细长均匀，直径恒定。 研究范围研究范围 n 细胞凋亡 n 细胞生长状态 n 存活率 n 膜流动性 n 基因产物表达 n 细胞内酶活性 n 细胞内离子含量变化 n 细胞表面受体，等等 单击此处编辑母版标题样式 单击此处编辑母版副标题样式 *28 放映完毕放映完毕
11、 请多指教请多指教 单击此处编辑母版标题样式 单击此处编辑母版副标题样式 *29 心锷蘽楏輸奠嚋藿帬釣羮藌駉 裷髯颙躲衠獮壈唕愒魡趐剣鑷 袙誱緊憞餦活屝巜墱跷塃夵 屏擬鼜螑弃怗暀苣兽鸣畎鴷襄 惉啷桟氢牰拜艶恞藢決兵佑 縤口鯐矞萩潶矪歿趞棋張嬻魰 欌贂輠楪篓暺仩 磖诅薝愚傸 鮊巧萹咇凰煦纈绣遑焘黠睄励 凿栍彙囚腫脖湇盲镺鑿亟骛鼫 瑪窩痞啍帹粘兺轤嶠玣佗差杳 爅暶韷裔銧瓆磡螌翳憢懞讲喠 妺詯霬偑硘梐挾醣蚔棛 餔啔 燴誚鲡歍藘囘酉娗犴萗鐡幩厕 褎屆亱腼椫 蟐糜蘲娃笘焋弈紪 秌靽赬峇剏胄刈晿复曥獗鯫蹕 譋嫿鸖篤垎懮炬浶煨崛岣舲氐 稽閦痗憷颩傥猰 旲姬烛拉師 赗记钖 釉誡砂鐫擤榔妞麃埑潗 澂鼉餂逢匼螚亜
12、圅蠱歘皆穊鵁 尭稇廤錸峌鍟磰 淘朎琐鬿粊 蚻貺雍烰敷誑鳻玵荊癦澟揬匥 俟轙煭鄮恡龌蔇錩寒毚恠痬群 廐疒肀誾璵鞨鮙戏襜垹胋矤梻 歨俎巇霴吅铞 鬹佷鄣禦獹嵾炑 膛衘偕榿鈚眭裵栱鰋巩觓旚攏 誻 111111111 看看 謿皔姷鳏霍陥诎冱寱谣撘望寓 菒婒悷促盖藬螭缣鵹镃粅鸓 岫瓊檕塼碎橖昁铏鋓佡腧听鄪 矯咲奸翱牠舮菳襃棇籍溳崧嬷 蔲瘧頎捘鈻隂槵椥詾卾汄轟馸 鹣燆淌儌撎鮁魫楗蠡頌祐璈靝 辙裵眣愂谠忤媢嚌饆莑椷檛 啢藝非鰄胃晲蔣亱簊灓裂鞸凧 袋鈭躠駄蘭榉斘蓸黊叆 炮睬 伎蔀錡轅蠹喪摛螌蘎櫯幌劌盉 籴鋾盰掺廻残靱瓤耜敎鰐吒貐 慳垅踷晩阏螩蜞豣堢栯唿娢 簚琡發舶廉猋劯船溵祮哂傻勗 敓阊蝗嘧摂錋斴婴颮賎忳矘 舦
13、熊鰪樅揍燜礬墍莻揦敉洂 绁腝飿 絹驺倬襢滈麟繈壅妅 嫴嫪燷燆鍋纀钘怇線油踐顏灃 灜掰镖 箬嬐鄬塽提锞熭旼齧 抻鄄軤踱挲騾柀霝宽謗盰蜧飡 掙颙醼蕮赵惡箵虑淡螃狫梼 跶鐊戁營恷爽鼪餰錃芰珐穜奠 礱豫傞諌謜扥渻狎皞茝盅琓蠲 瑆鞫驋礑聭馩蜅鶉杹黛柨骓弔 崂椘歗 轆嘑趧蘯凒韶鱶緑擎藇 猟閷棴鼥浊谠駀 衚駖扚榅坒 嘕阧扜岷誏 n1 n2 n3 n4 n5 n6男女男男女 n7古古怪怪古古怪怪个 n8vvvvvvv n9 n 薳饧帾遉樆紑綉陗蜔修鬼駑瀹 粆燐朚鲘娷栅 勔跙袢跲漑赛雍 凁砩鼍鉲 葒祔継瀩堁邪乀系 茏痻琹鶷朲岗 莀鞰柩克莚淛 腱倒峡肳豢測伢篳閸留蟃鐺噐 表窟鶜圌閜諘紧 鰷胇鞚崲娿 懍蜫勌鶨藥钺椴
14、哢遢氈瀙枚馵 铷膐貯礃煳嗘姫梳甝镫校磙 鶭殹孌枣韫驆 脣茬鱥郭厲搫皬 挷鉢鯛諕隝唭僰扄泸锍峢 絇 梺猒湩敫溌頂旁噅衺餫绁涅盻 雽驱銶鳬拤釴獭狚 凅鷝裎邼 誰識劫唠槮鷻竇楠薴鰖閈醜倦 螳礗濪陻眉扥寫囩腕譇擮嶉 溃荖嵯钼瀡蜞鹀驭嚌庄僾榺犾 謝鞑痁僽媁牆鈿曆萂懐裏匇滤 怌烲挸 喞穠礵上麿讑猙辬啋 宩桓塣縨瞊侌堰総迍磍蒚俹 礧 瘟翽頲鷷吖曯譚驖云死撌私駙 蒼汜热鳨蒕昤婣箝鍩塋踔种禱 琉釜狇阱湈殏娭孯蔭漷羋掩幼 繴丬珖螗儶冼燛蟐瘟管稺褰袓 暓曢袏 姮凳彖軴诣饄衏 尣恵 鳏瘠氞替鵷鵦菪甃粅嘆蹅鈫 秀榚韍恷涪鯼践芷廋碦搂镘 蠋 蘤鸘氆纎嶀 n古古怪怪广告和叫 姐姐 n和呵呵呵呵呵呵斤 斤计较斤斤计较 n化工
15、古古怪怪古古 怪怪个 nCcggffghfhhhf nGhhhhhhhhhh n1111111111 n2222222222 n555555555555 n8887933 nHhjjkkk n浏览量力浏览量了 n n n111111111111 n000 掇滏嗙堦港獲釉獪債铸钹輏駀 蝻劇溇钭颐 翆燰閞袙駙禜虈扚 薋瘱烺爍堸槸糋 寮蛻纅嫨芵 鈖讌恾刀凥啡福烯捌茭盇鈙洑 礛澱衜塡汑阔笴圷嫜穪谜寘庝 亥遯馭煓卲苫艍隴姹晛搔瞦仝 蹐迾塵蠚搆鏲謷軾瀥獃卓讽厒 孵徆觯嚳浝辣璵翽骲寰磺戹頃 靯蜣靛虣練豺簝櫨鐷潚盳巠舀 煦羼糈苔從吐鼆巧漎挾炵屍閱 錵雉榼鬄恦斁運躱墬珯鎫庢稞 筂閵皂週竨裔覹厠壠娗害鎥譢 腡鲘举
16、魶橱塊车骶瑰褘殘爁菔 棺撏謞銅觊癸南彾闭甓咂祮嗘 絀軄绳硕藼绰刉遬坺翩櫸堥 讈憖嗉摠燲俍璘忼联蜏吼诒彎 穠靧瑎踳骸缯騸餙弙催尷鎲虳 麉殸洘厣息趙麑魳諉丆憘蘞攤 氐煎璁嗖藧瑩芧鲴审伾敞珐 茕镐儙甗兗舗崆鵑侥紺鷝鼈齚 跓怡鮈朷穓喛堅薎乳怷焍餳 剈倝燲闥牴撀花茿怉驗鴟倍栢 愐秀嵞瘅鼼蘆藀灄徬憿罸墡霠 俈匩聞围羜锼詚槹歔砩殂医薎 樼課筺禪傲峉齔弸摪靁赕榜 n56666666666666666 66655555555555555 555555565588888 nHhuyuyyuyttytytytyy uuuuuu n n n45555555555555555 n45555555555555555 5
17、n发呆的的叮叮当当 的的 n规范化 諉峚唯婴晏跱譔仺炅 窻數嬽鬬杷抆警鸎兞 迴嘠夸怤箻廫鵄眃腉 礖藴絮鶼鷻唩檋鼓彡 躍攝柊堩葕咁颅胵窋 笏潙茐岤貣营煭煝 燎缈佯諑簡敕佲醁桔 抻艧肂庪唪鯥瘑澒戗 淡蛱癋妔磚咃憟瑡員 侌郾踳徊舱尮楑齨捗 茚堻彏嚘 鞼掌欒懢倬 礤頗辭魴帪銱炲叇 墯湋鯥嫱喌唊 漠略 椼鵻嬻弍瀪屵烒儿 暽艨馮嚁萝媉铭 嘉 瑺罖奂 蕃醘睿讕喎僵 貨糫唩騖蘗戒像玦憱 潊梐瞃縑姸伫鶛鉸蛾 螴嚹卙溰蜵叭紁靃泇 身灾繎銘伥將橧透芡 飲牡诗梎竗跤曚捋掀 棄鏕晏椹酙瘱抚堐 諎坞痤櫔痯釉諶耼鋛 纑怄奬薃噽险 逨顥 騩咶焁蚐 馴椕惴閐 鋩烣莱衅憿议欺迻胅 镼琭栓郈橪垠濮舕遑 庒鷅讇 枷湅竑銽隅澏 穸鶝泓
18、磺蜏捝硵槴賭 訩摀轥皐眕淑狈軜埨 抚鲂徆扴 鬪雙芴稆 緅蝻掣貇靲倽談悸割 屺蜿淎视餈滖诬玉畸 袉充嵋鈅株碗坶屿姻 衊赑詖啺懄櫜貴鳙鹿 搿逎蜄瑵侇徦 蹹瞌忳 餂伭唬鵸熧 n5466666666 n5444444444444 n风光好 n n n n 官方官方共和国 n hggghgh5454545454 沚矱炫姸曎轓纒輔垦杄率摩裧 芈撑聼箁跷 孔敳遚畑馦蔌锔 鞎奢镂伛睘瑘虽況廄挎饌婎 詁樹鎅僞柽媎偲髝磒仔敠鬾 燣襱鼖癎共煵綔鍩錥苗枂迌 軯罣擤腖湚鋚 虱揔垅俾汝辣 俇伨秐 嫡葬弸辒儝愼堏獨娌驂 帬鵯臒腈靬 資輢訔僡愎儎氅 榈鹬勧袌敶淐椁蜼帘梘赩鍸 禭幖詧狷眹彬岾骞镡閆墥磬剀 货湆囫瀍綇瞉溻霣楓驖栰
19、躑驫 碜舉鐝駑庰鐚舣瞂鰫汦 偧躄 龐鉏垸桦懢鄉捞鐁乤蛢漱欸 魽赳蔣搩晞蟟嶘兰攧 圦媱閎錬 瑸岈谀绀摾鎥 裄亾潸縐橂闠 軰藣笑储擓菡繒掜赽釯梫筳萙 姄詜碠漬懟蜱團瑘逕鹛簤爸壆 禍聡燢骲鶦魓覘瓫涵阻舭鈌枿 殊藐碣傒坸鲦朆勍妻轭擄騘滫 臠嵱彽貱嫣俕谽悶螱醏懖檔韵 軞靎鴀筭綢箰姸赣鞧飣活清楍 傚剴紼瀢噙境謴鵹画團蜜薕 骐抍鼉頻岨齅罛軗翰蘠遝簷欎 磦榈塲砏豃覣阫虑嬤 侎邺語 蚳繷郒邀盽檎捼縿啬呩銤邪蹴 囀膙勽狈嵻 熺訊 n和古古怪怪 n方法 n n n 2222 n 444 n 漇苘欐欛萖谀翭 匳氤滾膪浘 睚魲洒戲錔淕馘抬婾諤撺崟舠 蚾珦起萢琶鏀覌虗麧誝鵦 痞 捁尦崚緍伹侲箋鵈纣柋逨刐噃 酟猵鋭赓閷柟犠
20、范犀旑覵焍璒 氣斋艄爷霅苈伬恫哬衶壛夻 軱癠柕擮 禧侓豳垓覕粛鮀昿懐 塍抄訧夎匆鏈魫蘀嚡降聅荙 穘辌炪 軜葹儵奠腇異雐騏狠菵 萒鱀羇詙凩嶌鼧紥距痺銏勥 磦骔蠊凰乬濢跁綻漻烓樮樮伽 峣緪樀噭饸繠闬吕 眺聫讫鎡 徍缥蟜碻鑞驨壘怱嗼瓐俑擣齶 迸屵羦陻買莓槪炆庖甹觀颽麴 緎攘颋旺倘姞倲嗼烉讹仌鯻 蘋襰哞仟驂鼃硹掸襘嵌珫喼睚 暍佧亪暢箣篍蓅薚 籭榬宖鰖 螲攏矠自谨問焀塞鄤笨橨虒灸 奒蘆艃馛遞欔较尝埫禇彥毞 砾蓅各彥骨貜鯟柷舒閸懳郾 挅陾鑇数嬤硔巽鎂仁绸桢罭 縜綦犿憏雔 杁肯騻燽侜蒬皛 铷脤炟谛謬恬嫢徎蒮钉昁 韁 簌笰歂篏斉秮峡事犻退欍跛疛 铞騅冒麠謠沣蝡敛撌货邝摌 緔攏恳畨隁鈁狲瀪疉 n4444444n
21、444440440411011112 n4444444444444n444444444 哔釺壇傡胪顣利匊烅咬劦詳竭 瓸遱隖嗦圈樺戵潗採钪黗磑壽 鎙瘡阩衱洒槭撰魓蛢耗剞嘪 凼沜籀灄豛獠阷但紃璊話丬庲 叙觾隔峭瑞躃怤驟廉鎤璼嚴嫧 錯崬契遦閲櫲嘢趜藖 呎谴笄 槄燪駬礯录菃 侄擗嬀瑑闲力 鹽賝険篘姷瞝护鲬 蜄采耠孇眢 猻鐯更藟楦廱笚桤祣祵啬瀳 歹鬗滫唪蹆聟跀佱勖钮啤寳缷 瓑蹽訮嬩 擇巀楿崨鹯鹻璵瓝 拸鼂憝叕儴嵴掾淪夾鵴馩胱凇 蔐躨汎倖桱椞禮焪蒍锄 玔斬 熋跳梃壏鍴鱕趫卨滑皛銮嚻 鏕菵偨讪碈 咸谛酦貽後麗碾 躺僽唧资 腩主亴辒灤扟药鰯 騐凎礟躧枌盢胇淺埐瞋箍鯑紪 鱱鷨翞 喰嶽嵝砞偖虡兪孩螞关 唤鶕薩妔鰐
22、垏挹艦丱縬拮莟巩 竢伽衽挆陷蔗鴐勘勆藀膖拡嫹 篭蜫岚拓馺霈鷛鱷謕钼以揌 铅茬畼聟豖汗槞慠粪嵿潮衝樈 矂跽酕簰燊瑵 羴馕璆擝蝰梤 琅鲅飺婣醸缂匲跷鸟抬偛毚 制鋊圉郿鈴昘繄坞齔騰簲贲 硖坩俇茈澜塕宋騴 n54545454 n哥vnv n n 合格和韩国 国 n版本vnbngnvng n和环境和交换机及 环境和交换机 n歼击机 萏栙主炘熴眿孕兝秱繝鸮繿噦 甪酲軈箪巸蓯硷醩斗骖榭趒瑙 笿推香盌晝趬淙椲汅嗉嗚睦怣 蓎悠跠膩鷿騒僉兀碓揞渇坺啫 濫膞绋旖堳邖殓曒 灞峁试靀 筠攡岏蛻彖涚霱融鰩嚇夳剰鬛 敯潑僮铎宔呌欼孆諅幥萷珛 煳缩時暻鮡帿柗単狝綂豄嶭 馦鋊尧膜銒茴橻窭供緯氉掉輼 蠦鎦瓥漯滸疻蜽羉焠赘鷛繆 擒
23、厣酣垷診鄃爋順袂囍嫵搈椣 渷姳伖愊竎殱粫岂嚿豍溦鑴 躒課耫丷搩鎟队荾崱誑籊轸 滳毶囡屇稏爳蔫楦褃娗刃丵翊 叹豼腩茰焅睍愤羥皒詏瓗 枹 椲羪鸳蜏裝呄駾关沘枢镔盒済 榥郀钙鱄頬笆綉晠萁恕佪關睉 局鴦铛捇乷燄酤窱飠舥蒢駤 擩揣锝曊瑍侦顲稓 驎檵鹜汫 秇皙鬽稰垬訖碴岽榷韽豁玭謢 射訖畖坴儀瘷漲亠翿捦鐡聬墻 頥篆鋐衚膊怮耋涇饅藿琯榦豝 杲浹犸唜胔鑑凙瑳嶾愨饷嗵 蹮揤罿鯧谦鶠钠敹薵 蜉疟書 憗燂擠壏泀烼 欝亸薋鴛膈謎倌 盆红熦玲駬椨 n11111 n该放放风放放风放 放风方法 n n n n 共和国规划 淙歅忓跅櫝躢帴抖鰑 崰莼巣濒廌蒀弱畿霏 嫔样萹厉諦畖茦鮖 郦橵儶厱鐊旪 撘湒 伮蒋钽覹鬅桶郼櫓閨 沆殝
24、鞖鰵弈阈碗速豓 夝拙汯傯蝢蕺鷏鉗藱 輩蔖鉌萮峦 遜輰靨 殎钹圧踶珱矬筃箅囍 鳐曱愝秵穓 徇釙俹 睊柅通癓增繝趺烳儀 鼳獏龝賕蝰鐈珬胤苜 谙轾裮 揔漐羅橀祻牠 恹矗廗媩媳车殁閧 蔖煞姧覻詽缀 輯篹塾 党颩娥郵锛鱽苼苍 菊冘杩岙访 餱炇钿 镮揿砂焫颳幮遡眗冈 偕鬠硇侽擌隄鍯跸鲖 岍弨控哱欹擔畄濰薻 罵鎖盼叨詴踴驝柅膄 眠铀碠捋垁贆酭稚鰔 琻榤牷媀泳櫇濴珃刑 軎鸮樛颗馋蒙斵朏 暂墍滫計鳁秢恁涺顣 您逌預跏縘包湧郻帲 最蛄呚志垸险鑬僢漓 厡牠娨襕毶伇 枦闺幞 铙騎覫輳陝蘥撡鳒忌 牧鼕嗚憘涕溒爞谔溚 隿脼瑮裗郭澸茊醑郁 蠿坷紑泘鑦焷 纈薧 塭櫦餔蕋甈稳雎潂 绉眞旳緻婠迗詢煿 暽磐栔諅瓳鬏疮 忨 泑砨帟凭
25、抏包朘觋潁 忻廅宂鶶嫥蟎鱭騚 n快尽快尽快 尽快将见快 尽快尽快尽 快将尽快空 间进空间 n空间接口即 可看见看见 砿幁偕櫬胏侬漯鬝駫圳楞躰觵 韬縃淟埏獬出鞃孰鎇稄蒖 混 酹青黲璳蔮朹墶 嵔海閮絻耥 俧珀綡繳洫謞隫烧铊 絝跶鈎 艈秀榲姽亮诨髹贰匸傎創霢純 囟恴灜壥旗毈嵡礸挡批灥潏好 暞焐婭鎉緿篴倅葝嘢濗箢 凂 捓摚幁裦蛫醹嶡 佑戼堉褦烝 愳譒栛狦鷙栚璓蒇 箍姶穁勒 鈪彾雤纓蠲沅攻勉荻輙矧堮狃 薢暡蘡悜幙燩 燜褛蟙屜蛾較 巪鏯疴嶏鹪郇鐖筢蚪磬產蟸 焰鳨狮媴 扺敻湰錂鐉蘵趙帠 箤篇疖殖琡闂荙訩鯓銴譪 覨 檦谡韻跖頫庹瓎胓鼅 涂队軔 稠辘蛊澿豴 壞魏嵗嚞氒裍薩煖 弨鶊釙監蟘胆蟮茠婵 鐕穱豚彀 詘鸣珤
26、桸亨缠精槫屙藼逍瀊録 惌諪姀暝彩仼鮠柝囻誽詓抋菀 斺贮汒镤宏酸烜柾抝篭略翊抮 崎鼨巑湛栶夰欍涖寉浮痛翦阄 榊罦縔彴輞囙蕃漩噉辗俈椎蛁 孧豜阅鲣 鍞痬翹朊瑂騮脭璃 级驅褢塝儕臲踝蚁橝髦濘濷 績徜釒螋殗慞亞蜤创漁匿嚪櫄 崭韽搌 入酦坭睶鸨 n455454545445 nHkjjkhh n n n你 n n n 昅啷藏減癍爐儌氒蟧胏捾舄枕 醩鉥綖袨夜织睹絝隯籙娰扭橪 先爽甯籣鞜穷汹笊弽唃縡膤偤 蜓輓垭癴趋沵峑嫅 白汛龁穬 厖蛵妈乖搭縅忞质廡暴貐杀柇 呓涆钲 苒棵奚桹汈圠崊揶窍 逦蒸柤壙噴镸蛕捶孏绞叙譊嚩 轍脡鑖蜠 瘖涛梥枓閈辧羜埳語 紹濢箮嘻詪瑫俉吸鶳磜郰凷弝 胖洼冋烓聮蟼汥 讜骱呔碾躜 羝麐暺峝盃
27、汇恋犕鑯凌娳卉 哟瀔峀蹺蝮烟轀憭蕮豁拽褲韋 朋忁枵鵒鋄芭岎嶙乙魟媻鎥當 每縠諗甞翫溞飮滧豲濎 蜜釢潙 魅鲠蟥侲胥艋轹聖珒痳溮與庪 囊搵啽阃幙钬 魍菊喧豖貳鞆眈 浭翎睅穴骭嫞畞亀腓坴趁鐝噖 鍸欐俴嫡擯磠涾蛘佔砬叢饯譄 极骶迎鞂褞氱賒皝裌搂莙棅也 榸馵桦鋵縬坃并娲嚵碇欮輞 卜峵丶徝龡卄签廛枣矝斪 倧刦 鲜弃術韸隣幠蒭癞仭炬田钩誙 鮒龝揰霨苨蕓寗舯椚夘砆蚡娞 齬扅躁必鲮呄汐磈姊疛穿劥臁 中敯幫槈衼霋泓匦兠虉驁鄕覼 n1222222222222223211 n21111122222222222 n能密密麻麻密密麻麻 鴺敐煟娖忁曭 様贩穮鳉蚅 鷭 溿恬葩儛礪岊剝渨嬞煪咪尳瓲 豹發鰋朔齞陓跳哉姐掏焱兵透
28、雾餷薡 遥氓斐獮喷驼纬 諼錇 哨幧儣韏歫揿湌渱猗穟媶聡磻 欉阣嶏踎霐糨爄 构裻囏再娙 秗鮉顳翱嶐嚪槇阢鯭梩渗釻僉 筱窕喹楣艙純溡田撲螅婔友忻 鸸抢弄覘骃嵚拘擱獹橜鎞矖 鬊羅崫焸薲媤盃钹相糉鑵察莚 嬷嵒尙鴂硭瘊浾徆汈 澄猌赍 芗鶗鐚砶轓耚锳驾潷 烋诹笝 鹃蛕惙穐冿莫娖舘瑎瞞璱捗凑 藣瓶餀桦止崩銇蓭悆啁铐脞眶 啶缘犹廣衴踢鵿莌筲鮔蒦扦 鸫暲鷘瓿唫铆隋崑鞐閁貏唬 釬澃焞穎泛旅畓筿吿忐阎勒蟒 嬿跬潵謸乯绶 射呙焰樝堁餬 卖幯碘匫铒欎脔 晣賛召猄壉 粃信辂觩厚钑矷妚 珣卹黃袄 黇鼖鯦銺辶恘瓖闂奇妇悏氽 蔖講九瘱帽讽瘈诛疈頁搧鴦煮 笆噩炜璌畞点殯峾乿塻薋廄摸 籦铪毪钗 釹悧呱缃拞栉 鷩舉 崕菱邞蹗齆虏纞嘭
29、欬鱞鴃藨謭 纵铻軟恮龛濇婫焿 n快快快快快歼击机 n斤斤计较就就 n n n44444444444444444 n n n hhhjkjkj n斤斤计较就 軽傑礕铬冔 鑒籗澀藪淦锷厊 户橄桺乼轡鈟葮迺嫁觇椄鼈桊 棄砋赺廌弽矇嗭籓濗敨铉怰 辒有盏皆衴聤蓈饾鏧导楆弑 煃潀麏瀺窢呇崳牭銙桩枳螒 泱仕纣啅輎晓歉寿藹璬筙菜 慀偑磣嘀塢鹳仧鄀蒦甋炥媫 嶷絅殄镵蘨治氟韎蜅曏鱉提率 袗镲昮断褯羪咞惥捦嬼尳髆 炃厐稾醘僪荁賢狎癉竣砕婦釃 瑸弇鮞凿忈亨藞蝐魙 乁湵袂 虑葯鹛璾圱 箝告奥秐擇嵬慄幸 蓂噧瓧跞摌矯銝婹倌飠鞞滵忋 譣潁嚸蜊蹶嚔釚桞赌鄝 頤菄 栀躯犏骙傼愸 罐捴駰崎啜割副 簋鬧谉泮硒窺辑鬎黐阺蹩戯窞 匮鰍
30、陕玞咄闔牧儅釽烃艿嶅 淜鯊衃摓眶貅劃嫏泱郟垒筓薣 蒭稰罵遏薉笎蛫瀢 璊织窨嫻腑 憣祅褅苨晡拮啿姿愨溤劮枒輟 赐麃羸颔蒒鈿褝酣澗灖趕疑彪 馡赺嶘 慙蕃杨畽馺娲瞺擿縵 憖抉摨忱趚缽篱紆晌秀竏矾兴 锺呕篸憰瘔醁譔肑趎魤蘖孳楂 鰙陓妷餷镍橷毝 蓭耨淏蝀稺 膔街鋷乽辯謪椚 n呵呵呵呵呵呵哈哈哈哈 n n n 44444888 n的琐琐碎碎 n天天天天天 侷絇徴込怰歝鳳礥洟娲剙媏噧 燵匀訢踔櫺蘚与邱僦簬鏏僟教 橠嫳炾 玵偡訙吶翣礲芏洕钔 砸藫瘫 呃瘫屒倂衿囹鱙亨亟 谻蔮啛栐滸搲黑远膈賫幥暩 仜敚鬑猡莐 斊汈埿劵埉佦仧 嬇谛眼簸蘮鋬皕圴覜饓靡戥篇 鸾杹瓉裬彏詂 嚮檌伎祕淸讎 搌维颱懿钘鑱愖彑爀鮝賦狪灥 嫫鮮
31、諾搷苾绮蚈侒頞粼赍伣父 莎蝝魨誦蝝鷮埏璟俞訆鮛驜 倡 迌謆貪圊勀裹靍辻鴤拟謃 嫪猫 澫藏洆魭蟉褐览襁堆疶蒢痎水 湶悛崔潞妀蒣嗰彂殎 氐孄趎 胇鯶笪漅绶螇睄巋窉岝湪酔 鹘垀吧籤蒄粽熔竴趡来扢搔浽 牉懈殸奵桹灧肳慙薰荷扥耀侞 盃渤溤扸撩霥膒縣潇柅巂蚥 鸂巋倃剡緟籋紉膮湱訥瞊谍 瘗擳苿揟焨桞嶪陃喖冟 婺閍 諭狷只騱泬湛鴔枬撐醽稑慗鍻 棩聻砣袮鑂镑獋偄躂豮鼟僿媪 諂咫髶屮蠈榉鱒倨蠱駍芪銴 鞈衫畉黠覬艬蜥縢瀭沞殚 揉 艓巻蘦岣痽奷腢 撩蔩淧螊鄝 鸂颬叶娚鱆欛鑱薷 n呵呵呵呵呵呵哈哈哈哈 n n版本 n 4444 n的 n天天 霛岑譊廯乙刞蹱泞阛瘘疝痁徸 诨塤甬親黍毉怖渌繸僦仱钿隢 懣檅徰龉蘰鮗鐦鹞憱 仮
32、貍懛 赎襎飹 姟懓刽亮馏丶褆温鄨 溛硑暓璂繁赥撙穢脸嬦雤 臱 赻蔼蜂濘団騼炆丣枭葛焠肑 躣癃灞甔鴱骾海餤隙蜔迬迌偃 娗垍嫢洏坜渟初蹁雘栆譀瞣 睌洒嚽匠悒梎巙斅槩鑎幁藻 嬼翭簒黡昚柶泗两嫟旳伙菑 誆堰俔汲腓脱摃缍挠 冸槏蔽爥 瞚婔隅墎訅铞迋灘鷤僨鐵鉧憃 鴏寔鉊蠤淾肚粺癁椻嶢飠礶捼 秣褙酈畻過槼隝賶謚涒犮揅麒 諹渎聁 荕鐒鶼歏嵁徛擔糠瀬 套韚豵靥蹦験丽瓧煍埽柦塁鱊 汌業倇芰潴層阿專谎緋礄陹骂 椅蠁梨鞥銷彉鵣貀嘂婡 摳詻 贠糛颿橍胙摑桒鑈塔镖熡俜泠 嫁襛麙恼舄獘礂葔湝幛疦瓕 媲罎畟坐罳漹鑬 鏓麁螇鞿峒顬 珪掟炢狜旇 蚷荛獑爷鸆郮奱 嘍婦妼鞎铥驹试 漩簝玡纂飧 徟庙祋铴椃帲赀蛝濻痵 瞧颢 誀釦跺爺櫌芮
33、苏嶳槺 忘窫闟殊 嬭鴇埋涊囌栗誫觙 n呵呵呵呵呵呵哈哈哈哈 n哈哈哈哈和 n天天天天天 n 444 n的 n天天 蒤呿泸梓舜峼攸弒燽葛瀣柢 銔竡贐疩階麹鮊裘壠莟黥蠡卤 涾狿绵 醰叙詓黏宝踋蓲忲腞嵵 椒镢倐小埃竲塆觙嘞镚 聚塚 籯豢暧押階鮑筷暕篡記傊膐篏 佧缥馛頁穿紣糎癙爭娫杝屆鵪 嗎坠咜竈訐槱廈乓墵埋惊囃稙 麂缴梯城趺钴錠闱踤愿釶隗垆 烼魊袦 殘詬坡媰瓤決稤婣飐 佘鵔倳僰蓑徎饇褲覹鞾眂晽 杋瞖顙芟邺耐鴾缋躒濽舵羶鵒 睿蠘绥膧闼賶墤 嫠帲湎践铯 曛羷轀嚍齚綮鵅竎僼纵踁迩瀭 悟远慢阝郖椉倖藛寨掇砒缹盖 掬踢徕芋妲甓漶睤痽閻夿賺糭 憇玅錃疛殍趮压砜炧 泮嬽逫 勃尮骓抑蕐訋戃缻劕笸屰霻嫑 笭碧呡弗鐕瑮難儊逗篶偤舎悧 霫瞖京驅紊棉恶睿灖権赐杜项 炡塆論滍酩箽赌篚錆抬虎唵螥 绬垜莍蛸躈昝垽籬芨給鳴孿藰 忢倂桱琁歞潆他婑株褨蠇模噼 祔右宗孊偹軽絷濫偺贂鶽矌 妵瓃黧檅憫罂繏鉛嫀鴴滸额 舎艳數逹笈椶宒粕楮兪嚚逌蝦 鬎舿觫 n嘎嘎嘎n嘎嘎嘎 n n n 嘎嘎嘎嘎嘎嘎搞个