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1、1,是最简单也是最复杂的细胞信使。,Ca2+？,Ca2+作为一种重要的细胞内第二信使，携带许多重要的调节信息（钙信号 Ca2+ signals），调控着细胞内许多重要的生理和病理过程。,钙信号作用原理： 与效应蛋白的结合和解离，以及在不同细胞器之间的运动 跨膜移动产生电流（电信号）来实现其对生物学过程的调控。,我们的目的就是要阐明简单的钙离子如何有序地精细调节一个细胞内各种不同的，甚至是相反的生理过程。,2,第一节 心肌钙转运及其调节,有两套独立的肌管系统,横管（transverse tubule）或T管 纵管/肌浆网（sarcoplasmic reticulum，SR）走行方向与肌原纤维平行
2、,肌管系统：,纵行肌浆网（LSR、FSR） 在肌原纤维周围的SR。钙泵 连接肌浆网（JSR） SR的末端膨大或呈扁平状，与T管膜毗邻，上有钙释放通道。,一、心肌细胞钙转运蛋白,3,4,胞外 1-2 mM,胞浆 0.1M,0.6 mM,0.28 mM,细胞核 50 ,钙的不均衡分布,5,心肌细胞膜的钙转运系统,心肌肌浆网的钙转运系统,线粒体的钙转运系统,6,L-型钙通道 （ICaL） large-conduction and long lasting cuttent T-型钙通道 （ICaT） tiny conduction and transient current N-型钙通道 （ICaN）
3、 non-longlasting and no transient current P型-钙通道 （ICaP） 小脑Purkinje细胞 Q型-钙通道 （ICaQ） 神经细胞 R型-钙通道 （ICaR） 神经细胞,（一）钙通道,7,阈电位：-40- -30mV 慢通道： 激活慢（2030ms）, 失活更慢（100300ms）， 开放持续时间长 long lasting current 离子选择性差：Ca2，Na+，Ba2 阻断剂,1.L型钙通道,8,双氢吡啶类 (dihydropyridine,DHP) 硝苯地平 尼群地平 DHPR?,地尔硫卓类 (benzothiazepines,BTZ)
4、地尔硫卓 克伦硫卓,苯烷胺类 ( phenylakylamine,PAA) 维拉帕米 加洛帕米,9,2.T型Ca2通道 主要分布在窦房结细胞和蒲肯野纤维膜。 特点 去极化至-50mV时开放 低电导 tiny conductance（5-8pS） 失活快 transient 阻断剂：Ni2,mibefradil（咪贝地尔）,10,（二）Na+/Ca2+交换体,3种类型：NCX1、NCX2和NCX3，氨基酸序列同源性 达70,1. 分子结构,NCX1在心脏, 脑等许多组织表达 NCX2、NCX3只在少数组织表达,NCX 含有2个重复序列：1和2, 各包括40个氨 基酸，与离子转运密切相关,1968
5、发现，1990 clone（938aa.）,11,12,（1）Na/Ca 交换的化学计量学,3 Na+ 1Ca2+,2. 特性,反转电位取决于 Na+|o 、Ca2+o 、Na+i、Ca+i,（2）Na/Ca 交换的反转电位,生电性，电流方向与Na+ 移动的方向一致。,如Na+|o 140mM Ca2+o2mM Na+i 6mM Ca+i0.1M ENa/Ca -12mV 当Na+i由6mM 增加至10mM ENa/Ca -51mV,ENa/Ca = 3ENa - 2ECa,13,（3）转运模式,3,3,正向/前向Na/Ca交换,（钙外排模式）,反向Na/Ca交换,（钙内流模式）,14,决定N
6、a/Ca交换方向 的主要是膜两侧 Na+浓度、Ca2+浓度和膜电位：,AP最初1-3ms 病理情况、药物作用 使Nai,静息状态 AP大部分时间,当EmENCX时，钙外排：,当EmENCX时，钙内流：,15,外排Ca2+（前向交换） 参与兴奋-收缩耦联（反向交换） 与钙超载的关系,3.功能,16,反向钠-钙交换与心肌 ECC,17,反向Na/Ca交换与心肌变力性,18,4.阻断剂和激动剂,阻断剂 KB-R7943，主要阻断反向Na+/Ca2+交换,阻断钙 超载,尚无特异性的，非特异性的有ET（endothelin）, AngII，E-4031，受体激动剂等。,应用：减轻缺血-再灌注损伤（心、脑
7、、肾） 预防洋地黄中毒,激动剂,H,Na,Ca,Na,Na,Ca,19,（三）细胞膜钙泵 Ca2+泵是Ca2+的单向主动转运系统，在Mg2+ 存在下水解ATP，将胞浆内Ca2+转运出细胞。与NCX相比, Ca2+泵与Ca2+亲和力高，但转运量小。,肌浆网作为钙库在心肌电和机械活动中起关键作用，其功能改变可导致心肌兴奋-收缩耦联障碍及心律失常。,心肌肌浆网的钙转运系统,20,（一）钙释放通道 两种类型：RyR, IP3R 两个受体家族在结构上和功能上具有较多相似性，因此推测它们由共同的祖先进化而来。,C末端：为跨膜区域，构成功能性孔道。 N末端：形成球状头，投射到胞质，同各种开启 和关闭通道的信
8、号相结合。,calcium release channel,21,22,23,1. RyR （ Ryanodine Receptor ） 可与ryanodine特异性结合而得名。ryanodine是从植物中提取出来的一种生物碱，对肌浆网有双重作用：,在低浓度（nmol/L）与释放通道蛋白的高亲和位点相结合，钙释放通道开放， Ca2+释放。,在高浓度（mol/L）时，则与通道蛋白上的低亲和力位点相结合，使钙释放通道关闭。,在骨骼肌和心肌，RyR是主要的细胞内钙释放通道。,此外，Ca2+、咖啡因、ATP及其非水解性衍生物、蒽醌类化合物（如阿霉素）、Na+和K+等因素都可刺激RyR的开放；普鲁卡因、
9、钌红和钙调素等则可抑制RyR的钙释放,24,Isoforms of RyR,25,2.三磷酸肌醇（IP3）受体 在平滑肌与非肌肉组织，钙释放主要由IP3受体 来完成。, IP3受体有三种亚型：IP3R1、IP3R2和IP3R3。,心肌细胞已发现有IP3R 的mRNA和蛋白质的表 达，但含量明显低于RyR2。,虽然心肌细胞内主要的钙释放途径是RyR2，但激素调节心肌的收缩性则主要是通过IP3受体介导的细胞内钙释放进行的。,高浓度受体激动剂,内皮素,26,（二）肌浆网钙泵 （Ca2+-ATP酶） 肌浆网钙泵是心肌肌浆网膜上的主要蛋白质，约占肌浆网膜蛋白总量的4050%，分布于LSR（纵行肌浆网）和
10、JSR的非连接面。有3个基因编码5种亚型。 SERCA1：位于人16号染色体上，编码骨骼肌钙泵，其中 SERCA1a在成年骨骼肌表达 SERCA1b在新生儿骨骼肌表达,27, SERCA2：位于人12号染色体上，其中 SERCA2a心肌 SERCA2b在平滑肌和非肌肉组织的内质网表达 SERCA3：编码在肌肉和非肌肉组织表达的钙 泵，许多组织如心、脑、肺、肝、肾、子宫、小 肠、胰、睾丸和血小板等都可检测到低水平 SERCA3的表达。,28, 肌浆网钙泵活性的调节受磷蛋白 （phospholamban, PLB）,29, 非磷酸化的受磷蛋白：与钙泵结合，抑制其活性。 通过蛋白之间的相互作用，降低
11、钙泵与Ca2+的 亲和力。 磷酸化的受磷蛋白：与钙泵解离，消除抑制作用。 使钙泵与Ca的亲和力增高，转运速率加快。 PKA、Ca-CaM(钙调素)依赖性蛋白激酶、PKC和PKG可使 受磷蛋白磷酸化。, 肌浆网钙泵活性的调节受磷蛋白 （phospholamban, PLB）,30,以钙扣压素（集钙蛋白 calsequestrin）含量最高，主 要存在于JSR。心肌钙扣压素由391个氨基酸残基组 成，其结构上的主要特征是28%的氨基酸残基是酸性氨 基酸。,（三）肌浆网腔内钙结合蛋白,此外，肌浆网腔内还含有 histidine rich Ca2+ binding protein、sarcalumen
12、in和少量 calreticulin,意义：1）钙结合蛋白与钙结合可使SR内游离Ca浓度降低，有利于钙泵转运和贮存Ca 2）当SR上的RyR开放时，与钙扣压素结合的Ca2+迅速解离并释放入胞质,特点：1）高结合容量 2）低亲和力。,31,（一） 将胞浆钙转运入线粒体 钙泵 钙单向输送体（uniporter） Ca2+-HPO42- 同向转运体（symporter） （二）将线粒体内钙转运到胞浆 Ca2+-2H+交换 Ca2+-2Na+交换,线粒体的钙转运系统,在生理状态下，线粒体钙泵与Ca2+亲和力非常低，钙摄取速率又非常缓慢，因而人们认为线粒体不参与生理状态下心肌兴奋-收缩耦联的调节。,32
13、,在ECC过程中，钙瞬变是由肌膜和SR膜上的许多Ca2+转运蛋白完成的。 1胞质Ca2+浓度的升高,二、心肌兴奋收缩耦联过程中的钙转运,（1）L型Ca2+通道 约占10%20 （2）细胞膜NCX 少量 （3）SR Ca2+释放通道 8090%,33,2胞质Ca2+浓度的降低/恢复 (1) SR的Ca2+摄取 7090% (2) 细胞膜NCX 10%30 (3) 质膜Ca2+泵 (4) 线粒体钙单向转运体 （uniporter）,34,小结,35,（一）张力-频率关系 正性阶梯现象产生原因: 1）增加了单位时间内动作电位平台期的总长度，使通过 LCC 内流的Ca2+增多，SR Ca2+ load
14、增大。 2）除极引起的快Na+通道激活次数的增加使细胞内Na+水 平升高，Na+水平升高又通过NCX 使细胞内Ca2+水平 升高。,（心肌钙转运的调节）,三、心肌收缩能力的调节,指肌肉内在的收缩特性。许多因素如神经递质、激素、药物等直接或间接通过调节心肌钙转运来实现对心肌收缩能力的调节。,36,（二）通过cAMP的机制 1. cAMP提高心肌变力性的机制,cAMP是通过激活PKA来发挥作用的。被PKA磷酸化的心肌功能蛋白有 LCC、RyR、PLB、TnC。其主要作用包括： 1）使LCC的1和亚单位磷酸化来增加钙通道的开放概率。 2）使RyR磷酸化，增加RyR的开放。 1）2）作用可增加钙瞬变的
15、幅度，有助于提高收缩功能。,37,3）PLB的磷酸化解除了它对SR钙泵的抑制，提高了 SR钙泵摄取Ca2+的速率。 4）TnC的磷酸化导致其对Ca2+的敏感性下降。 3）4）作用可加速钙瞬变降支的速率，称为正性松弛效应（positive lusitropism),可提高心肌的舒张功能.,2.提高cAMP水平的途径： （1）激活AC 交感-肾上腺髓质系统、雨蛙素、胰高血糖素、前列腺素E、霍乱毒素、组胺等,38,（2）抑制PDE 异丁甲基黄嘌呤、茶碱、氨力农、米力农等 （3）cAMP的亲脂性衍生物 二丁基-cAMP，8-溴-苄基-cAMP，8-溴-cAMP等,（三）增加细胞内Ca2+,BAYK86
16、44、YC-170、H160/51、 BAYy5959等LCC激动剂直接与1亚单位结合，使钙通道开放概率增加。但这类药物大多伴有外周血管收缩，也使冠脉血管收缩，因此限制了其作为治疗心衰药物的临床应用。,39,（五）增加细胞内Na+ 洋地黄类药物 钠通道激动剂，如藜芦碱、BDF9148等 （六）钙增敏剂 Ca2+敏感性的调节 增加收缩蛋白对Ca2+的敏感性来发挥作用，这类强心剂也称为钙增敏剂。,（四）激动反向Na/Ca交换 Ang、内皮素、1受体激动剂、E-4031等,40,第二节 心肌细胞钙信号,多学科尖端技术的运用，包括膜片钳技术、钙测定技术（钙荧光探针）、激光共聚焦扫描技术、数字图像处理及
17、计算机和数学模型的运用，结合分子生物学方法，使人们在心肌细胞钙信号方面的研究取得很大进展。 在心肌细胞内可以观察到钙夸克、钙火花、钙波以及由心肌细胞膜去极化诱发的钙瞬变等几种形式的心肌细胞内钙变化。,41,一、钙火花兴奋-收缩耦联的基本功能单位,calcium spark,1993年Science,42,后来发现同类钙火花不仅见之于可兴奋组织（如心肌、骨骼肌、平滑肌、神经元），也见于非兴奋性组织和细胞，如神经胶质细胞、Xenopus occytes、植物根毛生长锥中的细胞。 Sparkology,43,指一组成簇存在于内质网 / 肌浆网上的钙释放通道，可以是 RyR 或 IP3R或二者的混合体
18、，在功能方面，包括Ca2+释放通道、通道复合体上的分子伴侣以及释放通道所在的内质网 /肌浆网。,单个CRU局部钙释放事件的光学记录，也叫“局部钙瞬变”。一般不考虑其来源及细胞种类。,钙释放单元(CRU),钙火花 calcium spark,44,1.自发钙火花 Spontaneous Sparks,（静息钙火花）,（1）形态特点 心肌细胞静息时，在很低的钙信号背景中会突然随机出现局部荧光信号的增强并快速消失：10ms内陡升一倍，然后在20ms内消失；直径大小约2m，体积约8fL。,45,钙夸克（calcium quark）, 它是由单个RyR释放出的Ca2+ 形成的。钙夸克空间上的总和构成了钙
19、火花。,当肌浆网腔内钙浓度达到一定阈值时就会引发SR RyRs开放增加，钙火花的幅度和发生频率均增大，易于激活邻近的CRU形成“复合型钙火花”，甚至产生钙波,钙超载情况下的自发钙火花,（2）产生机制 由SR上的一簇邻近的RyR自发地释放的Ca2+所形成，反映心脏舒张期胞内钙浓度约100nM时SR RyR2的正常开放。,机制：“超载引发的钙释放SOICR” Store overload-induced Ca2+ release,46,膜去极化时由LCC内流的Ca2+诱发SR RyR2释放Ca2+形成。,2.诱发钙火花 Evoked Sparks,47,单个诱发钙火花要么不产生（用Ba 代替胞外C
20、a；阻断LCC；或将电压升高至LCC反转电位以上）；一旦发生，其时程、幅度和空间范围只决定于CRU中RyR的状态和SR中Ca2+浓度，而与触发方式、强度无关。,单个诱发钙火花具有“全或无”的特征。,实验证据： 1）单个诱发钙火花与自发在形态学特征上无法区别 2）膜电位在一定范围（-50-+30mV）内改变时，单个诱发钙火花特性并无明显改变 3）FPL64176（增加LCC平均开放时间）并不影响钙火花的幅度和时程。,48,平滑肌细胞和骨骼肌细胞的钙火花： 在骨骼肌单纤维中，另一亚型的钙释放通道（RyR1 型）的开放也产生火花。 在血管平滑肌，钙火花则引起血管平滑肌的松弛。最 早是在大脑血管平滑肌
21、发现的。,机制：钙火花能激活邻近质膜上10100个KCa，引起自发一过性外向电流（spontaneous transient outward currents,STOCs），使平滑肌细胞膜电位超级化，减少Ca2+内流，从而产生舒张作用。,Science 270: 633637, 1995.NELSON MT, CHENG H, RUBART M, SANTANA LF, BONEV AD, KNOT HJ, AND LEDERER WJ. Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks.,49,在钙火花发生过程 中，常伴有ER/SR
22、内 钙局部清空现象。 钙火花和钙空穴是同 一事件分别在胞浆和 ER/SR上观察到的不 同表象，因此钙空穴 也叫做“skraps”,钙空穴 Ca2+ blink,50,形态特点 在共聚焦显微镜下可见心肌细胞内钙在某个区域瞬时性增高，并以很快的速度在细胞内传播（100 m/s），反映了细胞对高钙负荷后的反应。,二、钙波（calcium wave） 心肌静息状态下细胞内钙水平可传播性的增加,指某些情况下（如缺血或细胞内钙负荷增高等）心肌细胞内钙在局部自发性释放增加并伴以传播的现象。,产生机制 钙波来自于病理性高钙条件下钙从肌质网中的自发性释放。在高钙条件下，自发钙火花频度增高，更亮更大，且单个钙火花
23、可触发毗邻的钙释放和钙火花，这一连锁式的反应最终形成自传导性的“钙波。,51,Ca2+ Sparklet,Ca2+ Spark,Ca2+ Wave,52,钙波与在正常兴奋-收缩耦联时的钙释放不同，其传播不受膜上钙通道离子流的控制，一旦发生，就会传播到整个细胞，使舒张期细胞内钙增加：,病理意义,1）舒张期的钙自发性释放将会增加舒张期张力，并可降低下次正常心跳时的钙释放量； 2）胞内钙增高可激活NCX引起细胞膜去极化，是心脏心律失常的重要诱因之一。,53,三、钙瞬变（caicium transient） 心脏ECC时全细胞性钙的瞬时性增高,54,ECC中钙瞬变与钙火花的关系,在心肌AP期间，大量L
24、CC开放可触发单个细胞产生约104个钙火花，这些钙火花在胞质内发生时间和空间总和，形成瞬时性Ca增高，即钙瞬变。 当肌细胞膜上有效的钙通道数目被药物或抑制剂减少时，通常空间上均匀的钙瞬变就被打碎而成为钙火花。,钙瞬变是由于钙火花在时间及空间随机触发并叠加的结果。,55,目前最常用、最先进的细胞内测量技术都是通过荧光法（钙荧光探针）实现的。测量时采用单波长法和双波长比例测量法，原理： 荧光探针与钙结合后不仅产生荧光强度的变化，而且有激发光或发射光谱偏移。例如Ca2+ 与fura-2结合后，在激发光波长为340左右时,结合物荧光强度上升;而在激发光波长为380时,其荧光强度会下降;在fura-2的等消光点360时,其荧光强度与结合的Ca2+浓度无关。这样Ca2+浓度可以直接由两个激发波长上的荧光强度的比值来计算。,附：一种常用的钙测定方法,56,Ca2+I = kd (Fo/Fs) (R-Rmin) / (Rmax-R),Kd:荧光探针的钙解离常数 Rmax和Rmin：分别为100%钙负载和无钙情况下两个波长测得的细胞内荧光强度的比值 Fo/Fs：测量R的分母所用的波长（如fura-2的380nm）时测出的钙饱和及无钙条件下荧光强度的比值 R : 荧光信号比值（F340/F380）,57,