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1、克隆基因的表达及基因干扰,北京协和医院检验科 吴洁,1,克隆基因的表达及基因干扰,第一节 外源基因的表达,第二节 表达产物的分离、纯化与鉴定,第三节 基因表达干扰技术,2,克隆基因的表达及基因干扰,第一节 外源基因的表达,第二节 表达产物的分离、纯化与鉴定,第三节 基因表达干扰技术,3,第一节 外源基因的表达,遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程中心法则（central dogma）。,基因表达,4,外源基因在宿主细胞中表达。,外源基因,表达载体,重组载体,导入宿主细胞,在宿主细胞中 表达出蛋白质,提取蛋白,宿主细胞：,原核细胞或真核细胞。,第一节 外源基因的表达,克隆基因表达,5,第一节 外源
2、基因的表达,一、原核生物表达体系 二、真核生物表达体系 酵母，哺乳动物细胞,大肠杆菌,6,一、原核生物表达体系,（二）原核表达载体具有的特点,（四）包涵体,（一）对外源目的基因的要求,（三）真核生物基因在原核细胞中的表达,7,（一）对外源目的基因的要求 1、不应具有5端非编码区以及内含子结构 2、不能直接用真核基因组DNA. 3、常以cDNA为模板，设计引物，PCR扩增目的基因.,一、原核生物表达体系,8,选择标志 启动子 ：乳糖启动子lac，色氨酸启动子trp等 翻译调控序列，如核糖体结合位点(SD序列)，及 翻译起始点和终止序列 多克隆位点(MCS),（二）原核表达载体具有的特点,一、原核
3、生物表达体系,9,原核启动子,大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致序列： -35box 和 -10box（Pribnow box）,TTGACA,10,consensus sequences,11,核糖体结合位点（ribosome binding site, RBS）,Shine-Dalgarno（SD） sequence：,mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。,SD,mRNA 5AGGAGGUAUG,16S rRNA3,UCCUCCA,S-D序列距离AUG的距离也影响翻译,12,（三）真核生物基因在原核细胞中的表达,1.非融合型表达蛋白,2.融合型表达蛋白,3.分泌型表达蛋白,一、原核生
4、物表达体系,13,1.非融合型表达蛋白 载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白 质融合在一起。 优点：表达的非融合蛋白与天然状态下存在的蛋 白在结构、功能以及免疫原等方面基本一致 缺点：易被细菌蛋白酶破坏,（三）真核生物基因在原核细胞中的表达,一、原核生物表达体系,SD序列,ATG-外源基因-TAG,14,常用的非融合型表达蛋白原核表达载体pKK223-3 抗氨苄青霉素基因 tac启动子(trp-lac) SD序列 AUG起始密码 转录终止序列T1和T2,一、原核生物表达体系,15,2.融合型表达蛋白 表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。 优点： 具有抗原性可作
5、为抗原，可以抵御细菌蛋白酶的破坏。 便于融合蛋白的分离和纯化。,一、原核生物表达体系,16,融合型表达系统主要有 GST系统 His系统 金黄色葡萄球菌蛋白A系统 -半乳糖苷酶系统 麦芽糖结合蛋白系统,一、原核生物表达体系,17,启动子：tac 操纵基因：lacP 调节基因：lacI S-D序列 ori：pBR322 ori 融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）,GST系统-pGEX系列,1、载体组成结构:,lacI,tac,lac O,S-D/ATG,GST,插入位点,TGA,lacP,18,GST融合蛋白用Glutathione Sepharose亲和层析柱分离纯化。,GST系统-pGEX
6、系列,2、产物提纯:,3、产物分离:,用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从GST上切下来。,19,His-tag（组氨酸标签）：,在外源多肽的N端或C端接上6个组氨酸（6His）,His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被咪唑（或EDTA溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。,His系统,20,21,3.分泌型表达蛋白 载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞外。,一、原核生物表达体系,pIN III系列载体,pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3,Ipp,lac P,lac O,S-D/ATG,ompa,插入位点,22,
7、（四）包涵体 (inclusion body),一、原核生物表达体系,大肠杆菌高效表达外源基因时形成的膜包裹的高密度、不溶性和无活性的蛋白质颗粒。,23,（四）包涵体 (inclusion body),1.包涵体的形成 2.包涵体的分离与纯化 3.包涵体的复性,一、原核生物表达体系,24,1.包涵体的形成,表达产率过高，超出细菌蛋白水解能力，产物积聚，与目的蛋白中含硫氨基酸含量呈正相关。 原核表达体系缺乏翻译后修饰酶类和辅助因子，中间产物易大量积聚。 发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点,25,有利于目标蛋白的富集，使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞,以包涵体形式表达的重组蛋白
8、丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性、复性操作才能回收得到具有正确空间构象的目标蛋白。, 缺点, 优点,26,2.包涵体的分离与纯化,超声破碎菌体,离心,包涵体,溶解包涵体,强蛋白质变性剂： 盐酸胍、尿素（5-8mmol/L）,3.包涵体的复性,逐步降低变性剂浓度，使表达蛋白恢复其天然构型,27,（一）酵母表达体系,（二）哺乳动物细胞表达体系,二、真核生物表达体系,真核或病毒启动子,MCS,PolyA信号,终止子,外源基因,28,（一）酵母表达体系,1.酵母表达载体,2.酵母表达外源性基因的形式,二、真核生物表达体系,Dividing Saccharomyces cerevisiae (b
9、akers yeast) cells,29,1、酵母表达载体 选择性标志 大肠杆菌： Ampr、Tetr 酵母： Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+; 复制子 启动子 上游活性序列 转录起始点上游，可促进转录 终止序列 蛋白结构域 如：信号肽序列、核定位序列,二、真核生物表达体系,（一）酵母表达体系,30,2.酵母表达外源性基因的形式 非分泌型 分泌型,二、真核生物表达体系,分泌信号序列,31,Leu- 酵母,原生质体,感受态,酶去壁,CaCl2、 PEG,整合到染色体上或 独立在酵母细胞内,转化,Leu营养缺陷型培养基筛选,转化子克隆生长,酵母载体,大肠杆菌,提取,插入外源基因,鉴
10、定克隆,发酵表达,外源基因产物,分离、 纯化,酵母转化和表达的一般过程,32,（二）哺乳动物细胞表达体系,1.哺乳动物细胞表达载体,2.常用的外源基因转染哺乳动物细胞的方式,3.哺乳动物细胞的瞬时表达和稳定表达系统,二、真核生物表达体系,33,（二）哺乳动物细胞表达体系,1.哺乳动物细胞表达载体 (1)原核DNA序列 (2)启动子 (3)增强子 (4)剪接信号 (5)遗传标记 (6)终止信号和多聚腺苷化的信号,二、真核生物表达体系,34,2.常用的外源基因转染哺乳动物细胞的方式,二、真核生物表达体系,35,3.哺乳动物细胞的瞬时表达 和稳定表达系统 （1）COS细胞瞬时表达系统 （2）CHO细
11、胞稳定表达系统,二、真核生物表达体系,36,用复制起点有缺陷的SV40病毒侵染的猴细胞株CV-1得到的。所以称COS（CV-1，Origin, SV40）,COS细胞,37,利用COS细胞表达外源基因,38,克隆基因的表达及基因干扰,第一节 外源基因的表达,第二节 表达产物的分离、纯化与鉴定,第三节 基因表达干扰技术,39,第二节 表达产物的分离、纯化与鉴定,二、酵母重组表达蛋白的分离与纯化,三、表达产物的鉴定,一、大肠杆菌重组表达蛋白的分离与纯化,40,一、大肠杆菌重组表达蛋白的分离与纯化,1.粗制品的分离纯化,2.精制品的分离纯化,离心收集菌体,超声波破碎,离心收集上清,热处理变性,离心,
12、上清用硫酸铵沉淀,凝胶层析、离子交换层析,41,二、酵母重组表达蛋白的分离与纯化,1.酵母细胞内表达的重组蛋白质的分离纯化 以-蛋白酶抑制剂的纯化为例：,2.酵母表达分泌型重组蛋白的分离与纯化 以酵母表达干扰素纯化为例：,收集酵母细胞,玻璃珠破碎,离心取上清,DEAE Sepharose柱层析,梯度洗脱,收集活性部分,浓缩,葡聚糖凝胶G75柱层析,收集、浓缩,SDS-PAGE 纯度鉴定,发酵液用0.45m孔径滤膜过滤浓缩,DEAE-Trisacryl柱层析,梯度洗脱,收集干扰素部分,葡聚糖凝胶G75柱层析,洗脱,收集干 扰素,稀释,层析聚焦缓冲液洗脱,电泳鉴定,42,三、表达产物的鉴定,Wes
13、tern印迹（Western blotting） 1.蛋白质样品的制备 2.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 3.蛋白质的电转移(胶 膜),43,三、表达产物的鉴定,44,三、表达产物的鉴定,4.靶蛋白的免疫学检测 封闭 脱脂奶粉或BSA 靶蛋白与第一抗体反应 与第二抗体反应 HRP标记 显色,45,三、表达产物的鉴定,46,第七章 克隆基因的表达及基因干扰,第一节 外源基因的表达,第二节 表达产物的分离、纯化与鉴定,第三节 基因表达干扰技术,47,第三节 基因表达干扰技术,二、核酶与脱氧核酶,三、小干扰RNA( small interference RNA, siRNA),四、
14、微RNA( microRNA),一、反义核酸技术,48,一、反义核酸技术,（二）反义RNA技术,（三）反义核酸技术的应用,（一）反义寡核苷酸技术（反义DNA技术）,49,（一）反义寡核苷酸技术,1.反义寡核苷酸的作用机制,2.反义寡核苷酸的设计与合成,3.反义寡核苷酸的修饰,4.反义寡核苷酸的给药途径,一、反义核酸技术,50,（一）反义寡核苷酸技术 1.反义寡核苷酸的作用机制 (1) 抑制mRNA的翻译 (2) 抑制复制或转录 (3) 抑制蛋白质的加工、修饰及功能表达,一、反义核酸技术,51,2、反义寡核苷酸的设计与合成 1）设计 计算机软件预测RNA的二级结构 利用寡核苷酸随机文库鉴别mRN
15、A上的RNaseH切割位点、寡核苷酸芯片的扫描分析、随机寡核苷酸库结合逆转录分析法等对自然折叠的mRNA进行设计,一、反义核酸技术,52,2）合成 长度一般为1525个核苷酸 G-C含量为60%65%,一、反义核酸技术,53,3.反义寡核苷酸的修饰 最常见的是对ASON的骨架中的磷酸基团进行修饰 （1）硫原子代替磷酸二酯中的氧原子 （2）甲基修饰磷酸骨架 （3）聚酰胺键代替磷酸骨架,一、反义核酸技术,54,4.反义寡核苷酸的给药途径 （1）直接作用于培养细胞 （2）结合L-多聚赖氨酸或脂质体进入细胞 （3）动物模型则可通过静脉、腹腔、皮下、肌肉、瘤体内注射或气雾吸入等途径,一、反义核酸技术,5
16、5,（二）反义RNA技术,1.反义RNA的作用机制,2.反义RNA的设计,一、反义核酸技术,56,（二）反义RNA技术,1.反义RNA的作用机制 (1) 与引物RNA前体互补结合，抑制DNA复制 (2) 阻止目的mRNA的成熟及向胞浆内转运 (3) 抑制mRNA翻译 (4) 使mRNA更易被核酸酶识别而降解,一、反义核酸技术,57,2.反义RNA的设计 与ASON相比，反义RNA的设计较为简单,一、反义核酸技术,58,（三）反义核酸技术的应用,需要完善或解决的问题： 防止被核酸酶降解 需要进一步了解寡核苷酸进入细胞的确切机制 很多寡核苷酸易发生序列特异性和非序列特异性的结合 ASON是否会影响
17、正常细胞的基因表达 用载体导入反义RNA在体内表达时，存在安全性和转染效率不高等问题,一、反义核酸技术,59,二、核酶与脱氧核酶,（一）核酶：能够催化RNA剪接的由RNA组成的酶。Cech与Altman分享了1989年诺贝尔化学奖。,（二）脱氧核酶：1994年Breaker发现具有催化功能的DNA分子。,60,（一）核酶,1.核酶的分类,2.核酶的结构,3.核酶的设计与修饰 4.核酶转移方法 5.核酶的应用,二、核酶与脱氧核酶,61,（一）核酶 1.核酶的分类 （1）大分子核酶： 第类内含子、第类内含子、核糖核酸酶P （2）小分子核酶 ： 锤头状RNA、发夹形RNA、肝炎D病毒RNA和 neu
18、rospora Varkud satellite核酶,二、核酶与脱氧核酶,62,2.核酶的结构 （1）锤头状核酶： 二级结构有三个 螺旋环结构区和 一个催化中心,二、核酶与脱氧核酶,H：除G以外的任一核苷酸,不可逆的自切割反应,63,（2）发夹形核酶： 二级结构分成两个结构域，每个结构域由 螺旋-环-螺旋组成,二、核酶与脱氧核酶,可逆的自切割反应,BNGUC,B：除A以外的任一核苷酸 N：任意核苷酸,64,二、核酶与脱氧核酶,3.核酶的设计与修饰,设计 三要素：高效、特异、稳定 两方面：核酶核心与结合臂的设计 在底物RNA中选择最佳剪切位点 化学修饰 主要是对核酶的磷酸二酯骨架的修饰、戊糖环
19、的修饰和碱基的修饰。,65,二、核酶与脱氧核酶,外源性转移 物理方法：裸露DNA直接注射、电脉冲介导、 显微注射微粒轰击等。 化学方法：磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖、 脂质体等。 内源性转移 病毒载体（逆转录病毒或腺病毒载体）,4.核酶转移方法,66,二、核酶与脱氧核酶,5.核酶的应用,已利用组合筛选法得到抑制乙肝病毒复制的发夹核酶、抑制丙肝病毒复制的锤头核酶、能在体外抑制艾滋病毒复制的核酶。,为将核酶作为基因工程药物的开发奠定了基础。,67,（二）脱氧核酶,1.脱氧核酶的结构种类及特征,2.脱氧核酶的催化特性,3.设计合成脱氧核酶的原则,4.脱氧核酶的应用,二、核酶与脱氧核酶,68,（二）
20、脱氧核酶 1.脱氧核酶的结构种类及特征 （1）10-23型脱氧核酶：,二、核酶与脱氧核酶,嘌呤-嘧啶连接处,69,（2）8-17型脱氧核酶：,二、核酶与脱氧核酶,70,2.脱氧核酶的催化特性 （1）RNA切割活性 （2）DNA连接酶活性 （3）卟啉金属化酶和过氧化酶活性 （4）DNA切割活性 （5）N-糖基化酶活性 （6）DNA激酶活性 （7）DNA戴帽活性,二、核酶与脱氧核酶,71,3.设计合成脱氧核酶的原则 （1）总核苷酸数不超过50 （2）催化效率不低于核酶 （3）具有广泛的RNA切割功能 （4）能通过碱基配对与底物结合 （5）具有可重复性,二、核酶与脱氧核酶,72,4.脱氧核酶的应用
21、为治疗RNA病毒感染的疾病提供了一条新途径,二、核酶与脱氧核酶,73,三、小干扰RNA(siRNA),（二）RNAi的作用机制,（三）siRNA的设计原则,（四）siRNA的制备方法,（六）RNAi沉默效果的检测,（一）一般研究路线,（七）RNAi的应用,（五）siRNA的导入,74,（一）一般研究路线,三、小干扰RNA,75,（二）RNAi的作用机制 1.起始阶段 2.效应阶段 3.倍增阶段,三、小干扰RNA,76,三、小干扰RNA,77,（三）siRNA的设计原则 1.siRNA中G+C碱基含量 30% -70%，50%沉默效应较高。 2.siRNA作用位点 避免起始密码下游50-100碱
22、基处、终止密码上游100bp处及5端非编码区。 3.siRNA序列 避免连续4个以上A及3个G/C，须经BLAST(hppt:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)比对。,三、小干扰RNA,78,（三）siRNA的设计原则 4.siRNA碱基数 选择以A或G开始的21-23bp的目的mRNA。 5.环碱基数 一般为9个碱基，TTCAAGAGA 6.对照系统 将已设计siRNA碱基序列随机排列，且与其他基因无同源性。,三、小干扰RNA,79,（四）siRNA的制备方法 1.化学合成法 2.体外转录法 3.RNase 消化法 4.siRNA表达载体法 5.siRNA表达框架法,三
23、、小干扰RNA,80,三、小干扰RNA,81,小发夹RNA(Small hairpin RNA, shRNA),siRNA的合成方式及特点,三、小干扰RNA,（五）siRNA的导入 1.脂质体或电穿孔 2.病毒携带 3.细胞穿透肽,三、小干扰RNA,83,（六）RNAi沉默效果的检测 mRNA水平 RT-PCR、realtime RT-PCR、 Northern blotting 蛋白质水平 Western blotting、ELISA、 免疫荧光、流式细胞,三、小干扰RNA,84,Kumar PP et al NCB, 2007,RT-PCR,85,stable 14-fold CD8 kn
24、ockdown by lentivirus siRNAs,Rubinson et al Nature Genetics, 2003,Western blotting,86,（七）RNAi的应用 1.基因功能的研究 2.基因剔除 3.基因治疗 4.细胞信号传导途径分析 5.药物开发,三、小干扰RNA,87,Breakthrough of the Year,miRNA - 2002,四、微RNA(microRNA),88,MicroRNAs (miRNAs)是一种进化上保守，长2123nt，非编码的单链小RNA分子。,Eva van Rooij Circ. Res. 2011;108;219-23
25、4,四、微RNA(microRNA),89,mRNA,miRNA,No translation,四、微RNA(microRNA),MicroRNAs 在翻译水平调控基因的表达，绝大多数蛋白编码基因(人类约1/3的mRNA)受其调控。,90,四、微RNA(microRNA),（二）miRNA的作用机制,（三）siRNA与microRNA的区别,（四）miRNA的生物学功能,（一）miRNA的命名,91,miR-#（#代表数字）表示miRNA mir-#（#代表数字）表示相应的编码基因,（一） miRNA的命名,四、微RNA,92,miRBase Human miRNAs ( Jan 17, 20
26、11) http:/www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?org=hsa,93,（二）miRNA的作用机制 1.起始阶段 2.成熟阶段 3.功能阶段,四、微RNA,94,（三）siRNA与microRNA的区别 共同点 由22个左右的核苷酸组成 是Dicer酶的产物 需Argonate家族蛋白的存在 与RISC形成复合物起干扰、调节作用 可在转录后、翻译水平上干扰靶mRNA,四、微RNA,95,siRNA与microRNA的不同,四、微RNA,97,（四）miRNA的生物学功能 miRNA与生物体的阶段性发育密切相关，可以使特异基因在翻译水平被抑制,四、微RNA,98,99,Thanks！,100,