C-酶的催化活性和调节机制-2.ppt

《C-酶的催化活性和调节机制-2.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《C-酶的催化活性和调节机制-2.ppt（55页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、酶的催化活性和调节机制(2),3.6 酶促反应动力学,3.6.1 酶与底物之间的作用 酶的中间产物理论 酶分子（E）表面与底物（S）结合形成不稳定中间产物即酶-底物复合物（ES），它较底物需要较少的活化能就可继续反应，分解成产物（P）并释放酶。因此，ES 浓度决定着整个酶促反应速度。,3.6.1 酶与底物之间的作用,米氏方程 当 Km= S 时，则 v = 1/2 Vmax ，即当酶促反应速度达到其最大反应速度的一半时，Km值即为此时的底物浓度，其单位是 mol/L。 当 Km远大于 S 时，分母S不计，则v = Vmax S/Km，初速度与底物浓度呈一级反应。 当 Km远小于 S 时， Km

2、不计，则v = Vmax，初速度与底物浓度呈零级反应。,3.6.1 酶与底物之间的作用,3.6.1 酶与底物之间的作用,米氏常数（Km）的特性 Km与酶的性质有关，与酶浓度无关； Km最小的底物为该酶的最适底物； Km值与温度、pH等环境因素相关； 1/Km近似表示对底物亲和性大小； K3K1和K2时，KmKs Km随不同底物而异（酶专一性判断指标）,米氏方程求解方法,Lineweaver-Burk法 (双倒数法） 横轴截距为-1/Km，纵轴截距 1/Vmax，斜率Km/ Vmax。 缺点：点过分集中在直线左下 方，而低浓度S点因倒数后误 差较大，偏离直线，影响结果。,米氏方程求解方法,Han

3、es-Woolf法 横轴截距为-Km，纵轴截 距Km /Vmax，斜率1/ Vmax。,米氏方程求解方法,Woolf-Hofstee法,以vv/S作图, 得一直线。横轴截距为Vmax /Km,纵轴截距Vmax, 斜率 -Km,3.6.2 单底物较复杂的酶反应,多种活性中间产物 底物的抑制：酶分子上有两个底物结合位点，一为高亲和性，另一个为低亲和性。当其完全被底物占据时会抑制高亲和性位点的结合作用，使酶促反应速度降低，如果糖二磷酸酶。 多个活性部位：有多个亚基、多个活性中心，其动力学实验常很复杂，不符合米氏方程。,3.6.3 pH影响下酶促反应动力学,pH对酶构象的影响即对其解离基团的影响，就是

4、H+和解离基团间的结合与解离的变化过程,3.6.4 酶的抑制动力学,（1）不可逆抑制：抑制剂与酶分子中的必要基团发生共价结合，使酶失活。 按其选择性差异，不可逆抑制剂分： 专一性：仅与活性部位有关的基团反应； 非专一性：可与几类基团反应。如有机磷、砷、重金属（Ag、Pb、Hg）、氰化物 (沙林毒气）、CO及青霉素等。,3.6.4 酶的抑制动力学,（2）可逆抑制： 竞争性抑制：,加入 I 后，Vmax不变，Km变大(KmKm),I与S结构相似, 但E不能同时与S和I结合,3.6.4 酶的抑制动力学,（2）可逆抑制： 非竞争性抑制：,加入 I 后，Vmax变小，Km不变(Km=Km),3.6.4

5、酶的抑制动力学,（2）可逆抑制： 反竞争性抑制：,加入 I 后， Km 和Vmax都变小，且KmKm , Vmax Vmax,3.6.5 双底物酶促反应动力学,顺序有序反应 (如NAD+或NADP+的脱氢酶) A B P Q E E EA EAB EPQ EQ 顺序随机反应 (如肌酸激酶使肌酸磷酸化反应) 乒乓反应或双-置换反应 (如氨基酸转移酶) A P B Q E E EA FP F FB EQ,四、酶的调节作用,生命现象调节和控制层次： 整体水平调控：神经系统和激素； 器官、组织和细胞水平调控：体液； 分子水平调控：酶为中心的调控。 酶分子的调控方式：环境因素调控、别构调控、共价调控、酶

6、原激活调控、分子聚合调控。,4.1 酶自身活性的调控,4.1.1 环境因素调控 环境因素改变使酶构象稳定的力的平衡; 环境因素的种类：pH 、温度、金属离子、有机溶剂等； 例如溶菌酶：在细胞内合成后即具有完整的空间结构，但细胞内pH值约为中性，酶的活力很低，当溶菌酶分泌到细胞外偏酸性环境中pH 5时，溶菌酶的活性显著提高。,4.1.2 别构酶的调控,别构酶的特点：一般有多个亚基, 分子量大，结构复杂。有负责调节的别构中心和负责催化的活性中心。两中心位于不同亚基, 或同一亚基的不同部位。 别构效应：调节物或效应物与别构中心结合后，诱导或稳定酶分子的某构象，使酶催化中心的催化作用受到调节，从而调节

7、酶反应速度和代谢过程。 同促效应：酶分子上有两个以上底物结合中心，通过酶上结合底物分子数量而调节其活性。 异促效应：通过非底物分子的结合调节其活性。,4.1.2 别构酶的调控,别构酶的动力学特征：不遵循米氏动力学方程，具有正协同效应和负协同效应。 故有米氏活力酶、负协同效应酶和正协同效应酶的区分（Koshland规则）,Rs 为协同指数，n代表协同系数（Hill系数）。Rs=81：米氏方程; Rs 81：正协同; Rs 81：负协同。,4.1.2 别构酶的调控,别构酶机理模型 MWC模型（齐变模型）：1965年Monod, Wyman和Changeux提出。,无RT混合态,4.1.2 别构酶的

8、调控,别构酶机理模型 KNF模型（序变模型）：1966年Koshland, Nemethy 和Filmer提出,无RT平衡态,存在RT混合态,4.1.2 别构酶的调控,研究得较为清楚的别构酶是E. coli. 天冬氨酸转氨甲酰酶(ATCase), 它催化下列反应： 这个反应是合成CTP的第一步, 它受终产物CTP反馈抑制, 而被ATP激活。酶反应速度与底物浓度的关系曲线为S型, 说明底物有正协同性。加入负效应物CTP,活力降低, S型更明显。加入正效应物ATP, 活力升高, S型趋势变小，接近双曲线。 大多数别构酶均有这种S型曲线。,4.1.2 别构酶的调控,别构酶用加热、化学试剂或其它方法处

9、理后，它仍具有活力，但丧失了酶的调节性质。 如ATC酶经过温和的化学处理, 如用对羟基汞苯甲酸（PCMB）处理可解聚为两个催化亚基（为三聚体）和 3个调节亚基（为二聚体）。催化亚基仍有催化活力, 但不再受效应物影响, 调节亚基无催化活力, 但仍能结合效应物。更剧烈的处理, 如用SDS处理, 则催化亚基和调节亚基都各解聚成6个单体。,4.1.2 别构酶的调控,ATC酶受CTP抑制的生物学意义是避免合成过多的CTP, 而受ATP激活是为了保持嘌呤和嘧啶核苷酸合成的速度相称, 以满足合成核酸的需要。 别构酶在代谢调节中起着重要的作用。在合成代谢中催化第一步反应的酶或分支点的第一个酶往往是别构酶，以避

10、免形成一系列过多的中间体和终产物。在分解代谢途径中，则有一个或几个关键酶为别构酶。,4.1.2 别构酶的调控,如糖酵解途径中的磷酸果糖激酶是一个重要的调节酶，它受ATP抑制，而AMP可逆转 ATP的抑制作用。故当 ATPAMP比值降低时，也就是细胞内能荷降低时，糖酵解被促进，从而提供较多的能量。,4.1.3 共价调节酶,通过在酶蛋白某些氨基酸残基上增、减基团的办法调节酶的活性态与非活性态间的相互转化（可逆）。 有些酶存在两种形式，在其它酶的共价修饰后可以相互转变，如磷酸化酶催化下述反应： 磷酸化酶a: 不依赖AMP即有活性; Ser-14磷酸化; 磷酸化酶b: 依赖AMP才有活性; Ser-1

11、4无磷酸化。 b a 转变需Mg2+、ATP,4.1.3 共价调节酶,A. 共价调节酶的类型 磷酸化/去磷酸化 乙酰化/去乙酰化 腺苷酰化/去腺苷酰化 尿苷酰化/去尿苷酰化 甲基化/去甲基化 S-S/SH 糖基化 脂酰化,B. 常见共价调节酶,4.1.4 酶原的激活,酶原激活的特点： 不可逆的共价修饰调节； 在正常生理条件下，酶原不会过 早地在不适当的地方激活； 激活酶受抑制剂调控； 酶原的激活伴随着信号的放大。,4.1.4 酶原的激活,酶原激活常见的类型： A. 消化酶酶原的激活： 胃蛋白酶：从N端切除42个氨基酸，胃酸或胃蛋白酶； 胰蛋白酶：从N端切除6个氨基酸，肠激酶或胰蛋白酶； 糜蛋白

12、酶：内切14-15Aa，147-148Aa，胰蛋白酶；（羧肽酶、弹性蛋白酶）,B 凝 血 酶 和 血 液 凝 固,C. 某些蛋白激素的激活,胰岛素、甲状旁腺素、胰高血糖素、促肾上腺皮质激素等； 胰岛素：前胰岛素原（N端切除20信号肽）-胰岛素原（进入内质网腔，在中间切下29-35AA的C肽）-A链和B链。 人、猪和牛的C肽长度分别为31AA、29AA和26AA。,D. 发育过程和酶原激活,动物在发育的特定阶段，激活特定的酶发挥特殊的作用。 青蛙：在蝌蚪去除尾部时，体内胶原蛋白酶被激活； 哺乳动物：分娩后，子宫内部的许多胶原蛋白也被激活的胶原蛋白酶降解； 蚕蛾：在蛹成蛾过程中，激活茧酶，将蚕茧降

13、解。,E. 酶分子的聚合和解聚,由于酶与一些小分子调节因子的非共价结合，引起酶的聚合和解聚，实现酶在活性和无活性间相互转化。如Glu脱氢酶和乙酰CoA羧化酶 乙酰CoA羧化酶：催化脂肪酸合成。亚基的聚合和解聚，构成酶的三种存在形态：,常见酶的聚合和解聚与酶活性,4.2 参与代谢调控的酶,4.2.1 细胞空间上酶分布的分隔性： 不同部位分布不同的酶，保证生物反应不互相干扰。如脂肪酸的氧化和合成分处于线粒体内外，细胞液中的脂酰CoA需经肉毒碱脂酰基转移酶I和II催化，才能进入线粒体内进行-氧化; 而胞液要进行脂肪酸合成，线粒体中的乙酰CoA需经柠檬酸合成酶催化，与草酰乙酸缩合成柠檬酸(三羧酸转运体

14、系)，进入细胞液后，再经柠檬酸裂合酶催化，释放出乙酰CoA, 参与脂肪酸合成。,4.2.2 细胞膜中的酶,负责个区域间传送代谢物及离子。 周围蛋白：果糖二磷酸醛缩酶、甘油醛磷酸脱氢酶等。与磷脂的极性头部由静电引力相连，易于用盐溶液抽提出来； 镶嵌蛋白：氨基肽酶、-D-葡萄糖苷酶、腺苷酸三磷酸酶等。与磷脂的烃链因疏水作用而结合, 只能用去污剂或有机溶剂抽提出来。,4.2.3 细胞核中的酶,核液中的酶：糖酵解酶群，戊糖磷酸途径酶群，乳酸脱氢酶，苹果酸脱氢酶，异柠檬酸脱氢酶； 与染色质结合的酶：DNA核苷酸转移酶, RNA核苷酸转移酶II和III等； 核仁中的酶：核糖酶，RNA甲基转移酶, RNA核

15、苷酸转移酶I等； 核膜酶：葡萄糖-6-磷酸酶，酸性磷酸酶等。,4.2.4 线粒体中的酶,间质：三羧酸循环酶群，脂肪酸-氧化酶群，丙酮酸羧化酶，谷氨酸脱氢酶等； 内膜：NADH脱氢酶+呼吸链，腺苷三磷酸酶，己糖激酶，细胞色素C氧化酶等； 内外膜间空隙：腺苷酸激酶，核苷酸磷酸激酶等； 外膜：NADH脱氢酶，细胞色素b5还原酶，胺氧化酶，胆碱磷酸转移酶，磷酸脂酶A2，酰基CoA合成酶等。,4.2.5 溶酶体中的酶,含60多种水解酶, 多适用于酸性反应。 蛋白水解酶：组织蛋白酶，弹性酶，胶原酶等； 糖苷水解酶：溶菌酶，-D-葡萄糖胺酶等； 核酸水解酶：DNase II，RNase II； 脂类水解酶：

16、磷酸脂酶A1和A2等； 其他：酸性磷酸酶、芳香基硫酸酶等。,4.2.6 内质网酶,蛋白质的合成和传送、脂肪酸的合成及外来物质的代谢的场所。 平滑内质网：胆固醇合成酶，肉毒碱脂酰转移酶、药物代谢酶等； 粗内质网（胞液面）：蛋白质合成酶，葡萄糖-6-磷酸酶、ATPase等； 粗内质网 ( 腔面 ) ：核苷二磷酸酶， -D-葡萄糖苷酶等。,4.2.7 胞液酶,碳水化合物代谢酶群：糖酵解酶群，糖原合成酶，戊糖磷酸代谢途径酶群等； 脂类代谢酶群：乙酰CoA羧化酶，脂肪酸合成酶系等； 氨基酸和蛋白质代谢酶群：天冬氨酸氨基转移酶，氨酰tRNA合成酶等； 核酸合成酶：核苷激酶，核苷酸激酶等。,4.2.8 限速

17、步骤中调控作用的关键酶,在代谢反应中有一些反应实际上只有一个方向；这一类酶一般为别构酶。 如：糖酵解中的磷酸果糖激酶，催化1-磷酸果糖生成1, 6 - 二磷酸果糖； 还有硫激酶( 脂酰CoA 合成酶)、硫酯酶、乙酰羧化酶、丙二酰CoA脱羧酶等。,4.2.8 限速步骤中调控作用的关键酶,同工酶：理化性质不同,而催化相同反应的一类酶.对细胞生长、发育、遗传及代谢调节都很重要。 不同脏器来源的同工酶，依机体需要，完成同一代谢任务，如LDH1-5。 相同脏器来源的同工酶，各自起催化作用。如在肝脏中己糖激酶和葡萄糖激酶，都可以催化葡萄糖磷酸化，但在正常血糖浓度范围内，只有己糖激酶达到最大反应速度，而葡萄

18、糖激酶不同，在血糖浓度增高时，催化反应速度也同时增长。,4.3 酶调控作用的机制,酶调控作用的连锁性和放大作用 如激素-cAMP调节系统。 酶调控作用的反馈性：即某一序列反应的终产物(效应物)对催化该反应序列第一步反应的酶(常为别构酶)所呈现的效应，分正、负反馈。 如E.coli 天冬氨酸和氨甲酰磷酸合成CTP, CTP能反馈抑制催化第一步反应的酶，即天冬氨酸甲酰基转移酶（ATC），从而减慢其自身的合成；当由于代谢活动使CTP浓度减低很多时，此抑制减弱。,4.3 酶调控作用的机制,酶合成的诱导和阻遏： 诱导剂、诱导作用和诱导酶 许多细菌如E.coli 能在Glc培养基上正常生长发育，却不能立即

19、利用Gal。若将其移入含Gal培养基，2min后。它们能合成利用Gal的三种酶即-Gal苷酶、Gal苷通透酶和硫Gal苷转乙酰基酶，一旦Gal耗尽或重移回Glc培养基上，这些酶水平立即下降。,4.3 酶调控作用的机制,酶合成的诱导和阻遏： 阻遏剂、辅阻遏剂和阻遏作用 当E.coli 培养基中有Trp存在时，参与E.coli Trp合成过程的所有酶的生成受到阻遏。 操纵子模型（1961年，Monod & Jacob） 前提：A. 酶蛋白基因主要有：结构基因、操纵 基因和 调控基因； B. 基因表达共同控制部位：操纵子单位 如 Gal 操纵子。,4.4 兴奋性和抑制性调控蛋白,兴奋性调控蛋白 糖原

20、磷酸化酶激酶(PhK)由（）4 组成, 催化亚基为, 和亚基为别构亚基,最令人感兴趣的是, 它是一种钙调蛋白。 抑制性调控蛋白 这类蛋白与酶结合紧密，如牛胰蛋白酶抑制蛋白与胰蛋白酶结合后，解离常数只有10-13 M。在脊椎动物和无脊椎动物中广泛存在，可能对于调节激活后的水解酶具有作用。,五、 酶活性分析,5.1 酶活性概念: 催化一定化学反应的能力 酶活性单位（U）：单位时间内催化一定底物消耗和产物生成量的酶量.(U/ml U/g) IU：25C、最适底物浓度、最适pH值、最适缓冲液等条件下，每分钟催化1mol/ L 底物转化的酶量。 Katal（Kat）：最适条件下，每秒钟催化1mol/L底

21、物转化的酶量。 IU和Kat换算关系: 1Kat=6107IU,5.2 影响酶活性的因素,底物种类和浓度：一般要求底物浓度在7-10倍Km值，以最适底物为参照, 在1-3min内测定. pH值：常见几种酶的最适pH值(具有Vmax的pH),5.2 影响酶活性的因素,酶反应最适pH的测定: 钟型或倒U形曲线. 最适pH与酶的来源、代谢中所处地位及缓冲液种类有关。 酶的pH稳定性测定: 测定不同pH缓冲液酶活力； 酶反应的最适温度和测定：钟型或倒U形曲线. 最适温度与酶的来源有关。 酶的热稳定性：测定不同温度下的酶活力。 其他因素：离子（金属离子等）、小分子有机物（巯基乙醇、EDTA等）酶激活剂,

22、5.3 酶活性的保持,缓冲液和pH值：常用磷酸盐缓冲液，pH值与pKa相差0.5最好（6-8），缓冲液离子强度为10-50mmol/L。 温度：一般在4C或4C以下，但一些酶在温度低时会引起高级结构破坏而失活, 如Glu脱氢酶 辅助因子：用于维持分子的构象，有些脱氧酶需加入适量的NAD+或NADP+; 金属酶加适量金属离子. 保护剂：如甘油、牛血清等防酶分子分离. 酶浓度：一般浓度大保持活力较好。可加牛血清白蛋白、表面活性剂或多价醇等。 真空：防止-SH氧化。,5.4 酶活性的测定,酶促反应速率(单位时间底物消耗量或产物生成量)可作为酶活性大小或酶含量多少的衡量标准。 抽样法：也称中止法。酶与

23、底物反应一定时间后使其变性, 终止酶反应。测定方法包括比色法，化学法，放射性化学法等； 连续测定法：用仪器连续监测整个酶促反应过程。有分光光度法, 荧光分析法,自动分析仪法等； 快速反应追踪法：可以达到10-3s以下，有停留法；达到10-6s以下，温度跃迁法(温度瞬时变化)等。,4.5 蛋白质剪接,1990年Kane等首次报道，啤酒酵母细胞的基因TFP1表达产物有两种：69Kd的H+-ATPase和50Kd的小蛋白。并证明前者是一条完整肽链N端和C端两段拼接而成，后者恰恰是中间被剪切下来的肽段。 1992年Biolabs研究人员发现著名的Vent DNA聚合酶也为蛋白质自我拼接产物。 1992年Davis发现，结合分支杆菌中Rec A 蛋白的活性调节，也经过蛋白质的自我拼接。,