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1、用低交换容量聚苯乙烯型强酸性阳离子交换树脂柱色谱分离中性氨基酸Vo1.222001年l2月高等学校化学CHEMICALjOURNALOFCHINESEUNIVERSITIESNo.122l002103用低交换容量聚苯乙烯型强酸性阳离子交换树脂柱色谱分离中性氨基酸刘菊湘刘国栋阎虎生程晓辉何炳林姜根华.杨国英.(1.南开大学高分子化学研究所,吸附与分离功能高分子材料国家重点实验室,天津3000712.天津药业有限公司,天津300161)摘要遥过磺化苯乙烯一-L烯苯共聚物或商品化的聚苯乙烯型强酸性阳离子变换树脂(OOl7)的逆磺化反应.得到一系列不同交换容量的聚苯乙烯型强酸性阳离子交换树脂.研究了丙
2、氨酸和缬氨酸及缬氨酸和亮氨酸在这些树脂拄上的色谱分离.结果表明,用两种方法得到的树脂对丙氮酸和缬氨酸的色谱分离性能基本相同;同时中性氨基酸与聚苯乙烯型强酸性阳离子交换树脂之间的作用包括离子作用和琉水作用.且二者之间存在协同作用.树脂的变换容量较低时对中性氨基酸有更好的分离性能.关键词氨基酸l离子交换树脂;疏水作用色谱审围分类号TQ028.3文峨标识码A文章鳙号02510790(2001)1221OO一04由蛋白质水解液分离提取氨基酸是获得天然氨基酸的重要方法之一1.蛋白质的水解液中往往含有多种氨基酸,部分氨基酸可用等电点沉淀法及沉淀荆沉淀法分离,其它几组氨基酸由于其化学及物理性能非常接近,分离
3、较难分离中性氨基酸常用聚苯乙烯型强酸性阳离子交换色谱法.一般认为其分离原理是氨基与树脂上的磺酸基存在静电作用,由于不同氨基酸氨基的碱性存在微小差异,故可通过柱色谱分离.前文7,B1表明,在配体交换色谱分离氨基酸时,氨基酸的侧基与树脂的骨架可能存在疏水作用.文献6用聚苯乙烯型强酸性阳离子交换色谱分离氨基酸时,也曾提出氨基酸侧基的大小或极性可能对分离有贡献因此,在用聚苯乙烯型强酸性阳离子交换柱色谱分离氨基酸时,氨基酸的侧基与树脂骨架之间的疏水作用可能对分离有贡献.目前阳离子交换色谱分离氨基酸所用的树脂都为聚苯乙烯型强酸性阳离子交换树脂,其特点是交换容量很高.如果疏水作用对分离确实有贡献,则分离氨基
4、酸所用聚苯乙烯型强酸性阳离子交换树脂的交换量并非越高越好.本文通过合成不同交换容量的聚苯乙烯受强酸性阳离子交换树脂,通过研究交换容量对分离的影响来研究疏水作用对分离的影响,并合成出分离性能更好的强酸性阳离子交换树脂.1实验部分1.1屎辩及仪器0017凝胶型聚苯乙烯型强酸性阳离子交换树脂(南开大学化工厂),体积交换量2.02mmol/mL,粒度4060目.苯乙烯(工业品)和二乙烯苯(工业品,二乙烯苯含量为51.2,南开大学化工厂).其它试剂均为市售分析纯.HL一1恒流泵和BSZ一160自动部分收集器(I-海沪西仪器厂),Uv一754塑紫外分光光度计(上海第三分析仪器厂).1.2通过赘化及遨璇化反
5、应嗣备不同交换容量的强酸性阳离子交换树脂含7二乙烯苯的苯乙烯.-L烯苯凝胶共聚物参照文献9方法制备.将30g苯乙烯-二乙烯苯凝胶共聚物在250niL三口瓶中用30g1,2.二氯乙烷溶胀10mln,加人100g9Z.5的浓硫酸,慢速搅动,8O下反应一定时间后取样,根据文献9方法测定其交换容量.牧稿日期,2000一l0.1基金顼臣:天谇市重点科学基金项臣(批准号9801411)资助联暴人简介闻虎生(1959年出生).男,博士.教授,博士生导师.从事功能高分子和多肚台成研究.E-mailth.a.nec蛳刘菊湘等:用低变换客量聚苯己烯型强酸性阳离子交换树脂柱色谱分离中性氨基酸将100g0017树脂(
6、湿)悬浮于200mL5稀硫酸中,于103搅拌反应一定时间后取样,测定其交换容量.1.3氨基酸的柱色谱分离及分析鉴定将不同交换容量的H型磺酸树脂100mL装入2.0cmX50cm的玻璃柱中,将每种氨基酸的量相当于树脂柱交换容量5(物质的量分数)的丙氨酸和缬氨酸或缬氨酸和亮氨酸用0.1mol/LHCI溶解成0.2mmol/mL的混合氨基酸溶液注入柱顶部,进样速度2mL/min.用2倍于上述溶液体积的蒸馏水以相同流速洗至中性,用0.2moi/LNHC1洗脱荆以1mL/min的速度洗脱,自动部分收集器牧集,每5mL收集一管.每管各取1o皿样品,分别点样于新华层析纸上,用(正丁醇)/v(乙醇)/(乙酸)
7、/v(水)4/1/1/2的展开剂展开,1.0茚三酮/乙醇显色.剪下斑点,用4mL(O.1cusO)/v(75乙醇)一4/76的脱色剂脱色.测定脱色液在570D.m波长下的吸光值,再根据标准曲线计算氨基酸的含量.2结果与讨论2.1低交换窖强蘸性阳离子交换树脂的制备用92.5的硫酸磺化台7二乙烯苯的苯乙烯一二乙烯苯共聚物,不同的磺化时间可以得到不同交换容量的强酸性阳离子交换树脂(表1).由表1可见,苯乙烯一二乙烯苯共聚物的磺化速度相当快,磺化0.5h后其树脂的交换容量已达到1.00mmol/mL.磺化速度快可能造成磺酸基在树脂颗粒内分布不均匀,对分离不利.为了得到磺酸基分布较均匀的强酸性阳离子交换
8、树脂,我们采取逆磺化高交换容量的强酸性阳离子交换树脂(工业品,0017)制备低交换容量的强酸性阳离子交换树脂,即将0017悬浮于5稀硫酸中加热,使强酸性阳离子交换树脂去磺化(表1).由表1可知,逆磺化反应的速度很慢.由上述两种方法制得的具有相同或相近交换容量的树脂柱色谱分离丙氨酸和缬氨酸的结果(文中未列出)表明,这两种方法制得的树脂具有几乎相同的色谱行为.这可能是由于在直接磺化法中使用了较大量的溶胀剂1,2-二氯乙烷,因此磺化反应在树脂的不同部位进行得较均匀.Tab|e1SulfonaiJonofstyrenedivinylbenzenetopoiymerandreversed-sulfona
9、tionofstronglyar.k:llccationexchangeresm(0l7)2.2中性氨基酸在不同交换窖强蘸性阳离子交换树脂柱上的色谱行为中性氨基酸在强酸性阳离子交换树脂色谱柱上的交换平衡(以NHC1为洗脱剂)表示如下:-R-+n0一一SO-NH+SOH3NCH:o【)一NH+如果氨基酸在强酸性阳离子交换树脂柱上的保留仅由上述的离子交换引起,则氨基酸氨基的碱性越大,其保留体积越大树脂的交换容量越大,氨基酸的保留体积也越大.图1为丙氨酸和缬氨酸在不同交换容量树脂柱上的色谱图图1(A)所用树脂为0017,图1(c)和1(E)所用树脂由直接磺化法制得,图1(B)和1(D)所用树脂由逆磺
10、化法制得.由图1可知,缬氨酸的保留体积比丙氨酸的保留体积大.而缬氨酸氮基的碱性(p鼠=4.51)比丙氨酸氨基的碱性(pK4.31)小1,这和上面的推铡正好相反.其原因可能是由于强酸性阳离子交换树脂的骨架对氨基酸的侧基发生疏水嗳附作用引起的.因为缬氨酸侧基(异丙基)的疏水性比丙氨酸侧基(甲基)的大,因此树脂骨架对缬氨酸的琉永吸附作用比对丙氨酸的大.但聚苯乙烯型大孔吸附树脂对非芳香性的氨基酸基本无吸附作用,或者说聚苯乙烯骨架对非芳香性氨基酸的吸附作用很小,聚苯乙烯型强酸性阳离子交换树脂骨架的琉水性比聚苯乙烯型大孔吸附树脂的疏水性更小.而上述的色谱体系显示,强酸性阳离子交换树脂骨架与氨基酸之间可能存
11、在疏水作用.可能的解释是上述体系的树脂与氨基酸之间同时存在离子(静电)作用和疏水作高等学校化学VoI.22用,且两者之间存在协同作用.因为当氨基酸质子化的氨基与树脂上的磺酸负离子以静电结合后,氨基酸侧基与树脂骨架间的疏水作用相当于分子内的作用,由疏水作用而结合造成体系熵减小的值比此种作用单独作用时的小,因此,协同作用使氨基酸侧基与树脂骨架之间的疏水作用力增加,或者两种作用存在协同作用时的总作用力比这两种作用单独作用时的作用力之和大.700900110013001500700900110013001500700900110013001500V/mLV/mLV/mL7OO900lloo130015
12、00700900110013001500V/mLVnLF.1Chromatograntsofalanine(a)andvaline(b)onstronglycationicexchangeresincolumllswithdifferentionexchangecapacitiesc/(ram?rrIL);(A)2.02;(B)189(c)1.67;(D)1.49;(E)1.0O.当树脂的交换容量降低时,由离子交换导致的氨基酸的保留体积下降,但树脂的疏水性增加,因此由疏水吸附导致的氨基酸的保留体积增加.这两种作用对保留体积的影响正好相反.Table2Chromatographicparamet
13、ersofalanineandvalineonstronglycationicexchangei-encoJumltswithdifferentionexchangecapacitiesmL等AMaline.(mm?mLAJanmeValme(一?)20221725.41.170.4614915.9朋,91.440.87ll89l9.92411.210.551oo14.421.61500.97ll6716.821.41.27m82图1表明,随着树脂柱交换容量的降低,丙氨酸的保留体积下降.对丙氨酸来说,离子作用的影响比疏水作用的影响大.对于缬氨酸,当树脂柱的3,5交换容量由2.02mmol/mL
14、下降到1.67mmol/mL3.0时,其保留体积有所下降但当树脂柱的交换容量f2.5由1.67下降到1.O0mmol/mL时,其保留体积基2.0本不变.这说明疏水作用对缬氨酸保留体积的贡献ll5比对丙氨酸的大.这与上面的结论一致.表2为丙10氨酸和缬氨酸在不同交换容量强酸性阳离子交换树0.5脂柱上的色谱分离参数(容量因子为样品峰的保0?0留体积和死体积之差与死体积的比值,分离因子为被分离两个样品峰的值之比,分离度足为被FIg.2分离两个样品峰保留体积之差与两峰的半峰宽之和的一半的比值).随着树脂柱交换容量的降低,丙10l400180220Z600V,mLChromatgramofvallne(
15、n)andleeine(b)onstronglycationkexchangelesjncolumnExchangecapacity1.67mdJmL.76543ZlD.日.目一!l0_E.5N0112刘莉湘等:用低交换謇量蒙幕己烯型强酸性阳鼻子交换树麝拄色谱分离中性氨基酸2103氨酸和缬氨酸的分离度增加.图2为缬氨酸和亮氨酸在交换容量为1.67mmol/mL的强酸性阳离子交换树脂柱上的色谱图,其分离度尼为0.98.由于亮氨酸侧基(丁基)比缬氨酸侧基的疏水性大.其保留值也大.综上说明,中性氨基酸在强酸性阳离子交换树脂柱上的分离主要由其侧基的疏水作用控制.参考文献GteinJ.P.,Winitz
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19、iaoHuiHEBingLin,JIANGGen-Hua.,YANGGuo-ying.(1.StateKeyLohoratoryofFmzaiaalPolymerMaterialsfordrt妇andSeparation,jmfFofPlvm.s.Chemistry,mEUniversity,Tianj30007,G;2.rianfinPharmaceaticMCompanytriamjln30016?c)AbstractAseriesofpolystyrenebasedstronglyacidiccationexchangeresinswithdifferentionexchangecapa
20、citiesweresynthesizedv/a/hereversedsulfonationofacommercialpolystyrenebasedstronglyacidiccationexchangeresin(0017)orsulfonationofstyrene-divinylbenzenecopolymer.Thechromatographicseparationofalanineandvalineorvalineandleucineoncolumnspackedwiththeseresinswascarriedout.Theresultsshowedthatthechromato
21、graphicpropertiesofthetwokindsoftheabovementionedresinsontheseparationofalanineandvalinewerealmostthesame.Theretentionvolumeofalaninewaslessthanthatofvalineonthesamecolumnwithvariousionexchangecapacities,andtheretentionvolumeofvalinewaslessthanthatofleucineonthecolumnwiththeionexchangecapacityofI.67
22、mmol/mL-Theretentionvolumeofalaninedecreasedwhentheiooexchangecapacitiesdecreasedfr咖2.02to1.OOmmol/mL.Theretentionvolumeofvaiineslightlydecreasedwhentheionexchangecapacitiesdecreasedfrom2.02to1.67mmol/mLandremainedalmostunchangedwhentheionexchangecapacitiesdecreasedfrom1.67to1.00mm凸1/mL.Theseresults
23、indicatedthattheinteractionbetweenneutta1aminoacidsandthepolystyrenebasedstronglyacidiccationexchangeresinincludesionicandhydrophobieinteractions.Andtheremaybesynergybetweenthetwointeractions.Thebetterseparationefficiencyofneutralaminoacidmaybeobtainedbyusingtheresinwithalowerionexchangecapacity-KeywordsAminoacid;Ionexchangeresin;HydrophobicinteractionIChromatography(Ed.:W,X)1234567890