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1、细胞凋亡与疾病,病理生理学教研室 许燕,apoptosis,概述,凋亡过程与调控,发生机制,凋亡与疾病,凋亡在疾病防治中的意义,apoptosis,研究历史 定义 与死亡的区别 功能,概 述,概 述,早在1972年Kerr等已发现从细胞形态、超微结构和生化变化等方面来分析，细胞有二种死亡形式,一种是早被熟知的细胞坏死（Necrosis），另一种是创新提出的程序性细胞死亡（Programmed cell death, PCD）学说。但该学说到九十年代初才进入研究高潮，进展极快，现在普遍称之为细胞凋亡（Apoptosis）。,apoptosis,概 述,美国科学情报研究所（ISI）1997年SCI
2、（Science Citation Index）收录及引用论文检索，全世界自然科学研究中论文发表最集中的三个领域分别是： 细胞信号转导（signal transduction）； 细胞凋亡（cell apoptosis）； 基因组与后基因组学研究（genome and post-genomic analysis）。,apoptosis,定义,概 述,Apoptosis(apo-离开 ptosis落下),PCD（programmed cell death）,由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程,apoptosis,细胞坏死,概 述,特征：线粒体膨胀，细胞骨架降解，溶酶体释放酶
3、，细胞核内染色质沉淀靠近核膜边，蛋白质合成下降，由于膜破裂，出现炎症反应,一般过程：因补体反应或烈性病毒感染破坏了质膜，或者能量依赖性离子泵被破坏产生的钠钾等离子沿着各自的浓度梯度进入细胞，从而导致细胞吸水膨胀，最终破膜而死。,细胞凋亡与坏死的区别,坏死 凋亡,apoptosis,概 述,1.性质,2.诱导因素,强烈刺激，随机发生,较弱刺激，非随机发生,3.生化特点,4.形态变化,5.DNA电泳,6.炎症反应,7.凋亡小体,8.基因调控,被动过程，无新蛋白合成，不耗能,主动过程，有新蛋白合成，耗能,细胞结构全面溶解、破坏、细胞肿胀,胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩，核固缩,弥散性降解，电泳呈均一D
4、NA片状,DNA片段化（180-200bp），电泳呈“梯”状条带,溶酶体破裂，局部炎症反应,溶酶体相对完整，局部无炎症反应,有,病理性，非特异性,生理性或病理性，特异性,无,有,无,Apoptosis & Necrosis,坏死,凋亡,细胞凋亡的生理意义, 确保正常发育、生长 维持内环境稳定 发挥积极的防御功能 所以细胞凋亡是正常的生理过程，但是凋亡过多或过少都可引起疾病发生。因此，近年来对于细胞凋亡的研究，已成为医学界的关注热点。,apoptosis,概 述,例如 蝌蚪尾的消失 脊椎动物的神经系统的发育 发育过程中手和足的成形过程,apoptosis,概述 凋亡过程与调控 发生机制 凋亡与疾
5、病,apoptosis,凋亡过程与调控,凋亡过程,凋亡时细胞的主要变化,凋亡的调控,apoptosis,凋亡过程与调控,凋亡过程可大致分成4个阶段：,凋亡信号转导,凋亡基因激活,凋亡的执行,凋亡细胞的清除,凋亡诱导因素,受体,cAMP Ca2+ 神经酰胺,（第二信使）,胞内信号转导途径,激活凋亡程序,死亡信号,启动预定程序,凋亡相关基因激活 酶合成,核酸内切酶激活 Caspases激活,DNA切割 细胞解体,凋亡,apoptosis,凋亡过程与调控,凋亡过程,+受体,cAMP Ca2+ 神经酰胺,凋亡诱导因素,死亡信号,凋亡相关基因激活,DNase激活 Caspases激活,巨噬细胞吞噬分解凋
6、亡细胞,基因激活,apoptosis,凋亡过程与调控,凋亡过程,受体,cAMP Ca2+ 神经酰胺,凋亡相关基因激活,信号转导,细胞膜,细胞核,Dnase激活 Caspases激活,apoptosis,凋亡过程与调控,凋亡过程,DNase激活,Caspases激活,凋亡细胞的清除,凋亡执行,apoptosis,生化改变,凋亡过程与调控,凋亡时细胞的主要变化,形态学改变,apoptosis,（一）凋亡时细胞的形态学改变,凋亡过程与调控,细胞变圆 微绒毛消失 胞质浓缩 空泡化,凋亡小体,初期：,核染色质高度浓缩凝集在核周边,边集细胞体积缩小,中期：,胞膜内陷出芽,浓缩核裂解膜自行分割,致死前期可逆
7、期,致死期 不可逆期,晚期：,邻近的上皮细胞、M、瘤细胞等吞噬凋亡小体,（二）细胞凋亡 的生化改变,apoptosis,凋亡过程与调控,DNA的片段化断裂 蛋白质的降解,（二）细胞凋亡 的生化改变,1.DNase 作用：切割染色质DNA 特点：Ca2+/Mg2+增强活性，Zn2+抑制其活性 DNA内切酶活性被激活升高，双链DNA在核小体之间切断形成180200bp为基数的有序片段。,典型凋亡细胞DNA琼脂糖凝胶电泳呈现梯状条带,（二）细胞凋亡的生化改变,apoptosis,凋亡过程与调控,典型凋亡细胞DNA琼脂糖凝胶电泳呈现梯状条带,细胞凋亡的生化改变,特点：cysteine-containi
8、ng aspartate-specific protease（含半胱氨酸的门冬氨酸特异水解酶）,apoptosis,凋亡过程与调控,2.Caspases,作用：灭活凋亡抑制物(如Bcl-2),水解蛋白质结构，形成凋亡小体,水解凋亡相关活性蛋白,使抑制凋亡因子失活 破坏细胞结构 将调节区与催化区分离，使蛋白失活,Caspase 如何杀死细胞？,Caspases家族简介,1993年Yuan从哺乳类细胞中发现第1个Ced-3同源分子，叫白细胞介素-1转换酶（Interleukin-1 Converting Enzyme，ICE），Pro-ICE含404个氨基酸，分子量45KD。在一定形式下可自身催化
9、产生20KD和10KD二个片段，聚合形成（p20）2(p10)2杂四聚体，为活化的ICE。到1998年底为止共发现有14个Ced-3同源分子，分别定名为Caspase1-14。,Caspases的分子的结构特征,Caspases的分子均具有下列的结构特征： 以无活性的Pro-Caspases形式存在。 在Pro-Caspases的N端均含有一段P2-P27的前 区域（Prodomain）。 活性形式均是由2个大亚基（1720KD）和2个小亚基（1012KD）组成的杂四聚体。一分子Pro-Caspase只能分裂产生1个大亚基和1个小亚基 。 在大亚基的C端均含有QACXG（X=R.Q或G）的活性
10、中心，其中半胱氨酸（C）是必需氨基酸，故 Caspase是属于半胱氨酸蛋白酶类。,Caspase的分组,Caspase的分组有的是按其催化特异性而分为三组有的是按其前区域中共含某一具有嗜同性结合功能的区段分为： 1.CARD-Caspase:包括Caspase1,2,4,5,9,11,12,13等。 2.DED-Caspases 包括Caspase-8,10等。 3.下游Caspase 包括Caspase-3,6,7等。,apoptosis,细胞凋亡的调控,凋亡的调控,凋亡相关因素 凋亡信号的转导 凋亡相关基因,apoptosis,细胞因子：IL-2，神经生长因子 某些激素：（ACTH,睾丸酮
11、） 某些二价金属阳离子、药物,凋亡的调控,凋亡相关因素,诱导性因素：,激素和生长因子失衡,理化因素：高温、强酸、强碱、抗癌药物,免疫性因素:细胞毒T淋巴细胞CTL,微生物学因素：细菌、病毒,抑制性因素：,apoptosis,凋亡信号的转导,凋亡的调控,特点： 多样性：不同种类细胞有不同的信号转导系统 偶联性：死亡信号转导系统与细胞增殖、分化过程 中的信号转导系统在一些环节上交叉、偶联 同一性：不同凋亡诱导因素可通过同一信号转导系 统引起细胞凋亡 多途性：同一凋亡诱导因素可经过多条信号途径触 发细胞凋亡,凋亡信号的转导,与凋亡有关的信号转导系统： 1.胞内Ca2+信号系统 Ca2+在细胞凋亡中充
12、当了传递凋亡信号的角色；胞内Ca2+浓度上升可激活Ca2+依赖的谷氨酰胺酶，活化核转录因子等触发细胞凋亡。 2.cAMP/PKA信号系统 3.Fas蛋白/Fas配体信号系统,Fas配体或抗Fas抗体与Fas蛋白结合,神经鞘磷脂 酶活性,神经酰胺途径 诱导细胞凋亡,激活ICE样 的caspase,降解H1组蛋白 暴露DNase 的酶切位点,通过Ca2+信号系统 传递死亡信号,3.Fas蛋白/Fas配体信号系统,4.神经酰胺信号系统 电离辐射、TNF-、Fas抗原、糖皮质激素 5.二酰甘油/PKC信号系统 6.酪氨酸蛋白激酶信号系统 负调控作用,apoptosis,凋亡的调控 凋亡相关因素 凋亡信
13、号的转导 凋亡相关基因,凋亡的调控,凋亡的调控,细胞凋亡的相关调控基因,抑制凋亡基因：Bcl-2、EIB、IAP 促进凋亡基因: Fas 、Bax、P53、ICE 双向调控基因: c-myc、Bcl-x,第一个被确认的抑制凋亡基因 抑制凋亡机制： 1.直接抗氧化 2.抑制线粒体释放的促凋亡的蛋白质, 如Cyt c、AIF 3.抑制促凋亡因子Bax、Bak的细胞毒作用 4.抑制凋亡蛋白酶的激活 5.维持钙稳态,Bcl-2 B细胞淋巴瘤/白血病-2基因 (B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2),P53基因,wtP53 修复受损的DNA，如修复失败则诱导细胞凋亡,突变的P
14、53,失活的P53,丧失监视DNA损伤的功能,射线，毒素,P53蛋白,+,细胞凋亡,分子警察,促进凋亡基因,P53与细胞凋亡 P53是肿瘤抑制基因 P53基因是人类肿瘤有关基因中突变频率最高的基因 P53蛋白能特异地抑制Bc1-2的表达，相反对Bax的表达则有明显的促进作用。 在细胞中，P53蛋白的积累和活动引起了细胞凋亡。,3. P53与细胞凋亡 P53是肿瘤抑制基因，其产物主要存在于细胞核内。P53基因是人类肿瘤有关基因中突变频率最高的基因。在依赖P53蛋白的细胞凋亡中，P53基因是通过调节Bc1-2和Bax基因的表达来影响细胞凋亡的。P53蛋白能特异地抑制Bc1-2的表达，相反对Bax的
15、表达则有明显的促进作用。研究表明，P53蛋白是Bax基因的直接的转录活化因子。在这些细胞中，P53蛋白的积累和活动引起了细胞凋亡。,P53 野生型诱导凋亡 P53蛋白在细胞周期的G1期发挥检查点得功能,双向调控基因C-myc，Bcl-x,Bcl-x,翻译,Bcl-XL 抑制凋亡 Bcl-XS 促进凋亡,C-myc,生长因子(+) 诱导增殖 生长因子(-) 诱导凋亡,C-myc是一种癌基因，是调控细胞周期的主要基因。编码的蛋白是DNA结合蛋白，调控基因转录，在GF充 足时主要激活介导细胞增殖的基因；反之激活凋亡 基因。,C-myc,apoptosis,概述 凋亡过程与调控 发生机制 凋亡与疾病,
16、（一）氧化损伤学说 氧自由基的作用结果,细胞凋亡的发生机制, 钙稳态失衡 Ca2作为许多细胞生命活动的第二信使，在细胞凋亡中的作用也倍受关注，凋亡发生时胞浆中Ca2 ，并激活凋亡过程中的关键酶类，其诱导细胞凋亡, 线粒体损伤 目前证据显示，线粒体的功能改变在细胞凋亡 的发生中起重要作用 表现为 线粒体内膜通透性 线粒体内膜的跨膜电位m 能量合成水平 线粒体功能和结构破坏引起细胞凋亡的可能机制： 凋亡诱导因素作用于细胞后 线粒体内膜跨膜电位（m）下降， 线粒体内外膜之间的通透性转换孔PTP开放； 使细胞凋亡启动因子（Cyt.C）,凋亡蛋白酶激活因子（Apaf）和凋亡诱导因子（AIF）释放,apo
17、ptosis,发生机制,凋亡诱导因素,线粒体跨膜电位,线粒体PTP开放,Cyt.C,Apaf,等释放,AIF,潜在Dnase,活化Dnase,激活Caspases,细胞凋亡,线粒体损伤,以上介绍了细胞凋亡的发生机制 氧化损伤、钙稳态失衡、线粒体损伤。三者既可单独启动，又可联合作用，三种机制互相联系，互为因果，是很多凋亡诱导因素的共同通路，也就是所谓细胞凋亡的恶性网络假说（deleterious network hypothesis),Mitochondria in Apoptosis,apoptosis,概述 凋亡过程与调控 发生机制 凋亡与疾病,正常机体细胞生长与死亡的平衡,生长,坏死、凋亡
18、,正常机体,细胞凋亡与疾病,已知的凋亡相关性疾病,apoptosis,细胞凋亡与疾病的关系 该“死”的细胞不死，不该“死”的细胞却死了，也就是说无论凋亡过度或凋亡不足都可以导致疾病的发生。 细胞凋亡不足 细胞凋亡过度 不足与过度并存,凋亡与疾病, 细胞凋亡不足 肿瘤 凋亡抑制基因Bcl-2基因过高表达 促凋亡基因如p53基因突变或缺失，肿瘤发生率 自身免疫病 针对自身抗原的免疫细胞未被及时清除，机体产生了针对自身抗原的自身抗体或致敏淋巴细胞的攻击，导致器官组织损伤。 机体发育过程中，凋亡清除针对自身组织抗原的免疫细胞，而保留能够识别自身组织抗原的免疫细胞，并增殖成熟。如针对自身组织抗原的免疫细
19、胞存活、增殖，就可产生自身免疫病。, 细胞凋亡过度 心血管疾病 心力衰竭 心肌缺血与再灌注损伤 坏死与凋亡共存 发生机制：氧化应激；细胞内钙超载； Fas受体上调；p53基因转录增强 凋亡特点：早期凋亡为主，晚期坏死为主 梗死灶中央以坏死为主，周边凋亡为主 慢性、轻度缺血以凋亡为主，急性、重度缺血则常常发生坏死 缺血与再灌注损伤引起的细胞凋亡有时比单纯缺血更严重,2.病毒感染 病毒感染宿主细胞后有两种结局： 一是诱导细胞 凋亡从而限制病毒生长（肝炎病毒）； 二是由病毒基因表达的蛋白抑制宿主细胞凋亡，造成持续性感染或增加某些病毒的致癌可能性。 AIDS:由HIV感染引起，其关键是CD4+淋巴细胞
20、被凋亡，导致CD4+淋巴细胞显著减少，相关免疫功能缺陷。,HIV感染导致CD4+淋巴细胞发生凋亡的相关因素： 1）HIV的基因产物GP120能直接启动CD4+淋巴细胞的死亡程序 2）合胞体形成： 3）Fas基因表达上调 4）T细胞激活 激活诱导的细胞死亡 5）细胞因子 受感染的M释放TNF增多 6）tat蛋白： 诱导CD4+淋巴细胞产生OFR，增强 Fas表达 7）慢性感染时，受感染CD4+淋巴细胞作为效应细胞，可增强未感染的CD4+淋巴细胞对凋亡的敏感性, 细胞凋亡不足与过度并存,由于细胞类型的差异，各种细胞在致病因子作用下，有些可表现为凋亡不足，而另一些细胞可表现为凋亡过度，因此同一疾病或
21、病理过程中两种情况也可同时存在。 例如：动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）,细胞凋亡不足与过度并存,氧化型LDL 血小板激活 Ang 高血压 内皮细胞凋亡过度 平滑肌凋亡不足 动脉粥样硬化,细胞凋亡在疾病防治中的意义 细胞凋亡是一个程序化过程，可以通过不同的手段在不同的阶段进行干预而治疗疾病 合理利用凋亡相关因素 1.诱导靶细胞凋亡 放疗、化疗 高热、高温 2.减少细胞凋亡 NGF、促生长因子 抗氧化剂,抑制Bcl-2抗凋亡作用 促进促凋亡基因作用，如：ICE 引发氧化应激，增强P53促凋亡作用, 干预凋亡信号转导 调节凋亡相关基因 控制凋亡相关酶学机制 防止线粒体跨膜电位的下降,附：细胞凋亡检测,一、Annexin V-FITC结合膜表PS实验 二、细胞培养液LDH活性检测 三、核DNA片段检测 1.DNA Ladder 2.Tunel 法 四、镜检凋亡小体 五、 细胞凋亡反应核心因子检测 六、 流式细胞术,祝大家愉快,