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1、中药饮片鉴别及检验相关 知识培训,药检所 夏春丽,中华人民共和国药品管理法第二章第十条第二款规定“中药饮片必须按照国家药品标准炮制；国家药品标准没有规定的，必须按照省、自治区、直辖市人民政府药品监督管理部门制定的炮制规范炮制。省、自治区、直辖市人民政府药品监督管理部门制定的炮制规范应当报国务院药品监督管理部门备案。”中药饮片是中医临床方剂的基本组成部分，也是中成药的基本原料，其质量的优劣将直接影响到中医药临床疗效的体现，直接关系到人们用药的安全、有效。但是，随着中药饮片的市场需求量不断增长，及部分外来中药饮片的冲击，致使出现了大量的不按规定炮制方法炮制的中药饮片流入市场，从而导致了中药饮片的整
2、体质量有所下降。为进一步提升从药人员业务能力，进一步加大对药品生产、经营、使用的中药饮片质量监督力度，提高真伪鉴别能力，有效打击制售假劣中药饮片违法违规行为，确保辖区群众用药安全，区药监局组织人员在药品生产企业举行涉药人员中药饮片鉴别及检验相关知识培训。,近年来，中药材抽验不合格率居高不下，在这当中有大部分是一些不法分子故意造假（重金属超标的虫草、模具压制的人参、土豆染色做成的天麻等 ），售假。有的则是中药材保管发生变质。中药材的鉴别不具有一定中药鉴别常识是很难鉴别真伪的。安排这次培训的目的，为了方便从药人员能够对中药材进行简单的快速鉴别，根据中药的某些成分的特性，快速鉴别一些中药。,一、药用
3、植物学知识 1 、药用植物的分类 现以黄连为例示其分类等级如下： 界植物界 门被子植物门 纲双子叶植物纲 目毛茛目 科毛茛科 属黄连属 种黄连,2、植物组织的类型 .分生组织：顶端分生组织、侧生分生组织、居间分生组织 位于植物体生长的部位，由于分生组织细胞不断分裂、分化，使植物体得以生长 .薄壁组织：基本薄壁组织、同化薄壁组织、贮薄壁组织藏、吸收薄壁组织、通气薄壁组织 在植物体内担负着同化、贮藏、吸收、通气等营养功能，又称营养组织 . 保护组织：表皮(毛茸（腺毛 非腺毛）、气孔（平轴式 直轴式 不等式 不定式 环式）) 周皮（由木栓层、木栓形成层和栓内层三种不同的组织的复合体） 保护着植物的内
4、部组织，控制和进行气体交换，防止水分的过度散失，病虫的侵害以及机械损伤等。 . 机械组织：厚角组织 厚壁组织：纤维、石细胞 .输导组织：管胞与导管；筛管、伴胞与筛胞 .分泌组织：外部分泌组织 腺毛 蜜腺 内部分泌组织:分泌细胞 分泌腔 （分泌囊）分泌道 和乳汁管,3 、植物细胞的后含物 . 淀粉粒 三种类型 单粒淀粉 复粒淀粉 及半复粒淀粉 . 菊糖：多含在菊科和桔梗科植物的细胞中，山茱萸果皮中亦有。能溶于水，不溶于乙醇。可将菊糖材料浸入乙醇中制片，置镜下观察看见球状、半球状或扇形的菊糖结晶。 . 蛋白质 以糊粉粒状态存于细胞的任何部分，糊粉粒和淀粉粒常在同一细胞中互相混杂。 . 脂肪和脂肪油
5、：它是由脂肪酸和甘油结合而成的脂。在常温下呈固态或半固态称为脂。如柯柯豆脂；呈液体的称为油，如大豆油、芝麻油、花生油等。存在于植物种子里，可达种子干重的45%-60%；脂肪和脂肪油加苏丹试剂显橘红色、红色或紫红色；加紫草试液显紫红色；加四氧化锇显黑色。,、晶体：草酸钙结晶和碳酸钙结晶 .草酸钙结晶 ： .单晶又称方晶或块晶 豆科植物（甘草、苦参、葛根红芪、合欢花等）、芸香科（黄柏）中常见 .针晶 一般存在于含粘液的细胞中 如薯蓣科、天南星科半夏 白附子 兰科白及 石斛 天麻 百合科知母 麦冬 玉竹 .簇晶 蓼科（大黄、何首乌、拳参）棱角短钝； 五加科（人参、竹节参、三七）棱角坚； 毛茛科（白芍
6、、赤芍、牡丹皮）、桑科桑叶簇晶排行 .砂晶 茄科（颠茄、地骨皮） 苋科（牛膝） .柱晶 鸢尾科（射干） .碳酸钙结晶 多存在于植物叶的表层细胞中,、 维管束及其类型 维管束是一种束状结构，贯穿在植物体的各种器官内，彼此相连形成一个输导系统，同时对植物器官起着支持作用。 .外韧维管束：韧皮部位于外侧，木质部位于内侧，中间没有形成层。如单子叶植物茎的维管束 .双韧维管束：木质部内外两侧都有韧皮部。常见于茄科、葫芦科，夹竹桃科、萝摩科，旋花科桃金娘科等茎中维管束 .周韧维管束：木质部位于中间，韧皮部围绕在木质部四周。如百合科、禾本科 棕榈科、蓼科及蕨类的某些植物 .周木维管束：韧皮 部位于中间，木质
7、部围绕在韧皮部四周，常见于少数单子叶植物的根状茎，如菖蒲，铃兰等。 .辐射维管束：韧皮部和木质部相互间隔成辐射状排列，并形成一圈，总称为 辐射维管束。是单子叶植物的根和双子叶植物的次生构造特点。,二 、中药鉴定学知识 1 、 中药的加工及贮藏 . 常用的加工方法：拣 洗 切片 蒸 煮 烫 发汗 熏硫（山药 、白芷、干燥前用硫磺熏制，防止霉烂）干燥 . 贮藏保管中发生的变质现象 .虫蛀： 果实种子类，花、叶类及含糖类易虫蛀。一般含脂肪油（苦杏仁 桃仁等) 淀粉（白芷 山药）或蛋白质（蕲蛇等）易虫蛀，而含辛辣成分的药材，一般不易虫蛀如荜茇、胡椒、 花椒等。通常温度在16-35 、湿度在60%以上、
8、药材含水量在11%以下是虫害生长的有力条件。 .生霉： 大气中从有多量霉菌孢子，如散落在药材表面。在适当温度和湿度下，溶蚀药材内部组织，促使腐败、变质、失去药性。,.变色 各种药材都有其固有的颜色，贮藏不当颜色改变，药材也可能变质。含鞣质类药材受到氧化，聚合等作用，产生大分子的有色化合物，使原来色泽加深。 . 走油： 药材受潮、变色、变质后，表面呈现油样物质的变化；一般含脂肪油、挥发油或糖类成分的药材，如 苦杏仁、桃仁、当归、肉桂、麦冬、枸杞子等会产生“走油”现象。 . 其它。 有些药材在贮藏过程中所含有效成分会自然分解或起化学变化而降低疗效，如绵马 贯众，不能久贮。樟脑 冰片易挥发；芒硝(N
9、a2SO410H2O) 胆矾(CuSO45H2O)容易风化，应密闭保存。,1.3 贮藏及保管： 常温 030 阴凉库 不超过20 冷库 210（相对湿度 4575） .保管制度及保管经验 应有严格的日常保管制度，保持经常性检查，保证库房干燥、清洁、通风。注意外界温湿度变化，及时采取有效措施，调节室内温湿度。药材入库前应详细检查有无虫蛀，生霉现象，要经多名经验丰富的专业人员过四关：一看性状，二闻气味，三品尝，四查药材产地、药用部位是否符合（也称“放心”程序）。 凡有问题的包件都应进行适当的处理，只有合格的包件才能入库贮藏。贮藏的方法可根据药材的特性分类保管。容易吸湿霉变的中药特别注意通风干燥，必
10、要时可翻晒或烘烤；含淀粉、蛋白质、糖类等营养成分易虫蛀的中药应贮藏于容器中，放置通风干燥处，并经常检查。,保管经验：牡丹皮与泽泻共存，牡丹皮不易变色，泽泻不易虫蛀；花椒、细辛与有腥味的动物药共存，可防止动物药虫蛀。 .贮藏保管方法： （a）充分干燥，防止虫卵繁殖。中药材切制成片、段、节、丝后，改变了原药的形状，增大了表面积，极易受潮。饮片含水量在以上，温度在之间，药物中未除尽的虫卵会在此条件下化为幼虫。故中药饮片必须充分干燥，以杀灭虫卵，此为储存的基本要求。荆芥、薄荷、川芎、木香、羌活等芳香性药物不宜暴晒高温干燥，宜于低温干燥后入库。花类含芳香油及花蜜成分，极易被虫蛀，应在梅雨季节之前分包压紧
11、，烤至八成干，趁花热软时贮于石灰缸内，忌晒，以免散瓣退色。 （b）控制温、湿度，防止发霉变质。空气中存在着大量霉菌孢子，若散落在药物表面，遇适当温湿度就会萌发成菌丝，产生蛋白酶，侵入药材组织内部导致药材霉烂变质。当药物内部水分蒸至表面，温度在20-35时，霉菌开始繁殖。 故饮片的贮藏应低温、通风、干燥、控制含水量在8%-10%，库房相对湿度在65%以下，温度在25以下为宜。,（c）选择密闭容器，防止氧化变色。中药材的天然色泽是质量好坏的标志之一，色泽的变异，说明药物内在质量已发生了变化。如含有苷类、羟基蒽醌类及鞣质等成分的药物，由于贮藏过久或经常翻晒，其中所含有的酶在适宜温度下，会发生氧化还原
12、反应，使药材的色泽发生变化。含有蛋白质的药物，氨基酸与还原糖作用后也能引起中药变色。容易变色的药材如花类、全草、叶类等应贮于避光密闭容器中。如苏合香、藏红花等必须保持湿润状，否则易变色。加酒、醋炮制的饮片，如大黄、黄芩、延胡素等，宜置密闭容器内，以防酒、醋味挥散而失效。盐制品易受潮或高温后析出盐分，故宜放阴凉干燥处，切忌用金属容器存放。 （d）避免高温，克服走油现象。某些中药饮片由于受潮或在高温下表面溢出油状物，俗称走油。如含脂肪的杏仁、桃仁、郁杏仁、柏子仁等，含挥发油的当归、肉桂等，含有黏液性糖质的麦冬、天冬、太子参、枸杞子等也容易走油。干燥时不宜用高温烘烤或暴晒，宜贮于阴凉干燥处。又如种子
13、、果实类含淀粉、脂肪油较多的薏苡仁、麦芽、莱菔子、苏子等，炮制后可待蒸气散尽趁热装入容器内贮存；含油较多的药物宜凉透干燥后，置容器内盖紧，放于阴凉干燥处。,2. 中药饮片性状鉴定法 .形状 指干燥药材的形态。主要有片、丝、块、段、粒等性状，如观察皱缩的全草、叶或花类，可先浸湿使软化，展平。 .大小 指药材的长短、粗细和厚度，测量多用毫米刻度尺 。如泽泻片比黄芪片大，当归头片比当归片大；甘草的斜片比直片大。对细小的种子，可放在毫米方格线的纸上，每粒为一组测量平均值。 .色泽 应在日光灯下或常光下观察。如用复色，以后一种色调为主。药材的色泽不但帮助鉴别真伪，其色泽深浅，有时也反映其质量优略，如丹参
14、色红；黄柏色黄；玄参色黑。紫草深紫色者，紫草素含量较高。桔梗皮部白色，木部黄色，习称“金井玉栏”等。 .表面特征：样品不作处理，直接观察或借助于放大镜观察。观察表面特征时，特别是附属物，要注意其颜色、性状、纹理、分布等特点。如片面上何首乌的“云锦花纹”、银柴胡的“珍珠盘” 、粉防己的“车轮纹”、黄芪的“菊花心”；段上的纵纹、纵沟；丝、块上的毛、刺等各种附生物的形态、分布等。必要时可对光透视。,.质地 指药材的软硬、坚韧 、疏松 、致密、 黏性或粉性等。软硬 坚韧多凭手感而定，疏松 致密 黏性 粉性等全凭眼睛仔细观察。如山药片粉性足，郁金片坚硬，通草质松软，蜜炙饮片黏性大等。 .断面 包括折断时
15、横断面的纹理特征。如杜仲折断有橡胶丝（盐炙后橡胶丝不明显）；甘草易折断，断面纤维性等。 .气味； 一般可直接嗅闻或口尝。气味较弱者可采用折断或揉搓的方法，也有的需要热水湿润后才能闻到。 .水试 将药材浸泡一定量水中，观察形态变化。菟丝子的吐丝现象 .观察在水中的沉浮 如：丁香沉于水中为佳；进口沉香能沉于水或半浮半沉于水中，国产沉香大多不能沉于水中。 .观察颜色变化 如：西红花浸入水中，可见橙黄色成直线下降并逐渐扩散，水被染成橙黄色，柱头呈喇叭状；熊胆粉末投入清水，即在水面旋转，并呈现黄线下沉而不扩散；栀子水浸液为鲜黄色；玄参水浸液为淡黑色；秦皮水浸液日光下显碧蓝色荧光。 .观察有无粘性 如：海
16、藻水浸后藻体表面粘滑；葶苈子、车前子加水浸泡种子表面粘滑，水煮后溶液有粘性。 .观察膨胀情况 如：胖大海水浸泡迅速膨大成海绵状，达原体积4倍，假胖大海水浸泡膨胀较慢，仅能达原体积的2倍；蛤蟆油水浸可膨胀至倍。 .观察其他特殊变化 如：菟丝子水浸加温后便逐渐出现吐丝现象（种皮开裂可露出黄白色卷旋状的胚，形如吐丝。）；水牛角热水浸泡有腥臭气；蟾酥遇水即泛出白色乳状液等。,.火试 将药材加热或燃烧观察产生的现象。如火上燃烧海金沙，有爆鸣声且有闪光，而血竭于滤纸上烘烤，熔融呈血红色。 .嗅气 饮片燃烧过程中会产生各种不同的气味，如：砒石粉末燃烧时有蒜臭气；血竭燃烧时呛鼻，有苯甲酸样香气。 .听声 饮片
17、燃烧会发出不同的声音，如：麝香用火烧时有轻微的爆鸣声；海金沙燃烧时会出现爆鸣声及闪光现象。 .观烟雾 饮片燃烧过程中或燃烧后会产生不同颜色的烟雾，如：青黛用火烧时有紫红色烟雾出现；松香燃烧时发出粽黑色浓烟；马勃燃烧熄灭产生大量白色浓烟。 .看颜色 饮片在火焰上燃烧或燃烧后会显示不同的颜色，如：麝香灰化后残渣呈白色或灰白色；芒硝在火焰上燃烧火焰呈黄色；自然铜燃烧时产生蓝色火焰。 .注意其他变化 如：沉香燃之有油渗出；雄黄燃之易熔融成红紫色液体等。,3 其他鉴别方法 .显微鉴别 指用显微镜来观察饮片的组织结构和粉末中的组织形态及内含物特征等等，从微观角度鉴别饮片的真伪优劣。 .理化鉴别 指用物理、
18、化学或仪器分析方法，对饮片中所含成分进行定性。主要是通过显色、沉淀、升华物等饮片成分的特殊反应，从内在质量方面鉴别饮片的真伪优劣。 .含量测定 指对饮片中有效成分或主要成分的含量测定，这是鉴别饮片和评价饮片质量的最可靠、最准确的方法。对药效成分明确的饮片，规定其含量指标，并进行检测非常必要。 三 、中药饮片商品知识： 中药材品种据全国中药资源普查记载已达12807种，其中植物药11146种，动物药1581种，矿物药80种；2005版药典收载538种，其中植物470个；药动物药48个；矿物药20种；陕西省中药饮片第一册收载180个药材品种，323个饮片品种。,1、中药饮片的概念 所谓中药饮片，是
19、指在中医药理论的指导下，可直接用于调配或制剂的中药材及中药材的加工炮制品。这个概念表明，中药材、中药饮片并没有绝对的界限，中药饮片包括了部分经产地加工的中药切片（包括切段、块、瓣)，原形药材饮片以及经过切制（在产地加工的基础上)、炮炙的饮片。对于前两类，管理上应视为中药材，只是根据中医药理论在配方、制剂时作饮片理解。而管理意义上的饮片概念应理解为:“根据调配或制剂的需要，对经产地加工的净药材进一步切制、炮炙而成的成品称为中药饮片”。 目前，中药饮片的概念大致有三种观点： （）根据“饮片”一词的出处，即清代吴仪洛在本草从新中“药肆中俱切为饮片”的说法，很多人认为“凡动过刀的即为饮片”； （）某些
20、中药材专业市场和城乡集贸市场药材经营户认为只有经过复杂加工炮炙工序的成品才是饮片，仅经净制、切制方法加工而成的应称为“切片”，而不应按“饮片”管理；三、根据药典定义，“饮片是指经过加工炮制的中药材，可直接用于调配或制剂”。 中药饮片是中药材经过按中医药理论、中药炮制方法，经过加工炮制后的，可直接用于中医临床的中药。,2、讲究使用道地药材：道地药材是药材中精华，它是指那些历史悠久，品种良好生产及加工技术成熟，质量优良的著名药材。 产于河南怀庆府的“四大怀药”怀地黄 怀牛膝 怀山药 怀菊花 产于浙江的“浙江八味”浙贝母 浙玄参 杭菊花 杭白芍 杭麦冬 山茱萸 延胡索 白术 产于东北的“三宝”人参
21、辽细辛 北五味子 产于云南的“云药”云木香 云茯苓 产于贵州的“贵药”贵天麻 朱砂 产于四川的“川药”川乌 川厚朴 川黄柏 产于广东 广西及海南的“广药”广豆根 阳春砂 产于陕西 甘肃 青海新疆及内蒙西部的“西药”西大黄 岷当归 藏虫草 产于湖北 湖南 江苏 安徽 江西 福建 台湾的“南药”江枳壳 宣木瓜 建泽泻 产于河北 山东 山西 内蒙的道地药材“北药”潞党参 北柴胡 多伦赤勺,3、适宜选用细贵药材：主要是指药材资源少，疗效显著，价格昂贵的中药材。如人参 鹿茸麝香 牛黄 虫草 西红花 海龙 海马 蛤蚧 羚羊角 三七 天麻 4、按规定使用毒性药材,麻醉中药有罂粟壳；使用时必须按照国家有关法规
22、规定进行特殊管理。 5、了解进口药材品种的主产地区 西洋参、鹿茸、“乳香、没药及血竭”是我国主要的进口药材。经云南瑞丽口岸进入我国的缅产药材主要有：补骨脂、槟榔、大腹皮、酸枣仁、壳绿砂、绿净砂、蔓荆子、黄草、郁金、木蝴蝶、姜黄、干姜、白扁豆、儿茶等30余种，我国需求量较大的品种有十几个。,薄层鉴别相关知识 一、概述 薄层色谱法，系将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，成一均匀薄层。待点样、展开后，与适宜的对照物按同法所得的色谱图作对比，用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法。 1.仪器与材料 (1) 玻板 除另有规定外，用5cm20cm，10cm20cm或20cm20cm的规格,要
23、求光滑、平整，洗净后不附水珠，晾干。 (2) 固定相或载体 最常用的有硅胶G、硅胶GF254 、硅胶H、 硅胶HF254,其次有硅藻土、硅藻土G、氧化铝、氧化铝G、微晶纤维素、 微晶纤维素F254等。 其颗粒大小,一般要求直径为1040m。薄层涂布,一般可分无粘合剂和含粘合剂两种;前者系将固定相直接涂布于玻璃板上, 后者系在固定相中加入一定量的粘合剂，一般常用1015煅石膏(CaSO4.2H2O在140烘4小时)，混匀后加水适量使用，或用羧甲基纤维素钠水溶液(0.50.7)适量调成糊状，均匀涂布于玻璃板上。也有含一定固定相或缓冲液的薄层。 (3) 涂布器 应能使固定相或载体在玻璃板上涂成一层符
24、合厚度要求的均匀薄层。 (4) 点样器。 (5) 展开室 应使用适合薄层板大小的玻璃制薄层色谱展开缸，并有严密的盖子，除另有规定外，底部应平整光滑，应便于观察。,2.操作方法 (1) 薄层板制备 除另有规定外,将1份固定相和3份水在研钵中向一方向研磨混合,去除表面的气泡后，倒入涂布器中,在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布（厚度为0.20.3mm），取下涂好薄层的玻板，置水平台上于室温下晾干，后在110烘30分钟，即置有干燥剂的干燥箱中备用。使用前检查其均匀度（可通过透射光和反射光检视）。 (2) 点样 除另有规定外，用点样器点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边2.0cm，样点直径应小于或等
25、于3mm ,点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。点样时必须注意勿损伤薄层表面。 (3) 展开 展开室如需预先用展开剂饱和，可在室中加入足够量的展开剂，并在壁上贴二条与室一样高、宽的滤纸条，一端浸入展开剂中，密封室顶的盖，使系统平衡。 将点好样品的薄层板放入展开室的展开剂中,浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.51.0cm（切勿将样点浸入展开剂中）,密封室盖,待展开至规定距离(一般为1015cm),取出薄层板，晾干，按各品种项下的规定检测。 (4) 如需用薄层扫描仪对色谱斑点作扫描检出，或直接在薄层上对色谱斑点作扫描定量，则可用薄层扫描法。 薄层扫描的方法，除另有规定外，可根据各种薄层扫描仪
26、的结构特点及使用说明，结合具体情况，选择吸收法或荧光法，用双波长或单波长扫描。由于影响薄层扫描结果的因素很多，故应在保证供试品的斑点在一定浓度范围内呈线性的情况下，将供试品与对照品在同一块薄层上展开后扫描，进行比较并计算定量，以减少误差。各种供试品，只有得到分离度和重现性好的薄层色谱，才能获得满意的结果。,二、薄层鉴别的操作规程 1.方法原理 薄层色谱是一种微量分析的分离过程，它将样品点在以玻璃板或铝、塑料等片材为载体的多孔吸附剂薄层的固定相上,利用流动相在特定的展开室中将混合物中的组份推移到不同距离处，在色谱展开整个过程中，样品的成份受到正反不同的力的作用。 (1) 流动相利用毛细管力带着样
27、品穿过固定相。 (2) 样品与固定相的相互作用是指组份在移行过程中由于偶极 - （诱导） - 偶极相互作用，氢键和范德华力的作用而产生不同程度的延缓、吸附、分散、离子交换和络合等分离机理。 由于样品组份与流动相和固定相之间的相互作用力程度不同，整个毛细管流动过程中分离运动都在进行。基于这点，TLC系统（流动相和固定相）必须与样品很好地匹配。 用显色试剂处理，许多组份可在日光或紫外灯光下检视。色谱可用肉眼或使用光密度计和照相机记录或影像系统方法来评价。,2. 薄层板 2.1手工自制玻璃板的要求:用于制备薄层板的玻璃板要求表面光洁、平整，最好使用厚薄12mm的优质平板玻璃，普通窗玻璃一般不宜用于制
28、作薄层板，玻璃板需洗净至不挂水，晾干，贮存于干燥洁净处备用。玻璃板反复使用时，应注意经常用洗液及碱液清洗，保持玻璃板面的光洁是保证薄层板质量的最基本要求 2.2制作方法:除另有规定外，将1份吸附剂加适量的水（如1份硅胶G一般加3份水），在研钵中用研钵沿一个方向小心研磨至成均匀的有适当粘稠度的胶浆,立即倾入涂布器中,均匀地向前推进涂布在玻璃板上;或按照不同涂布器的规定操作涂布;涂布好的薄层板于室温下在水平台上晾干,再在规定的温度(一般为105110)下烘约30分钟活化,贮于干燥器中备用。薄层板的厚度一般为0.250.5mm.。 2.2.1铺板 铺板用的匀浆不宜过稠或过稀：过稠，板容易出现拖动或停
29、顿造成的层纹；过稀，水蒸发后，板表面较粗糙。匀浆配比一般是硅胶G:水=1：23，硅胶G:羧甲基纤维素钠水溶液=1:2。研磨匀浆的时间，根据经验来定，与空气湿度有关，一般通过拿起研棒时匀浆下滴的情况来判断，越稠越难下滴。匀浆的稀稠除影响板的平滑外，也影响板涂层的厚度，进一步影响上样量。涂层薄，点样易过载；涂层厚，显色不那么明显。通常，板的质量对薄层鉴别的影响不是很大，影响最大的是展开剂的配制和展开系统的饱和。,2.2.2点样 尽量用小的点样管。如果有足够的耐性，最好只用1微升的点样管。这样，点的斑点较小，展开的色谱图分离度好，颜色分明。样品溶液的含水量越小越好，样品溶液含水量大，点样斑点扩散大。
30、样品溶液的溶剂一般是无水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。点好样的薄层板用电吹风的热风吹干或放入干燥器里晾干。 2.2.3展开剂配制 选择合适的量器把各组成溶剂移入分液漏斗，强烈振摇使混合液充分混匀，放置，如果分层，取用体积大的一层作为展开剂。绝对不应该把各组成溶液倒入展开缸，振摇展开缸来配制展开剂。混合不均匀和没有分液的展开剂，会造成层析的完全失败。各组成溶剂的比例准确度对不同的分析任务有不同的要求，尽量达到实验室仪器的最高精确度，比如：取1ml的溶剂，应使用1ml的单标移液管，移液管应符合计量认证要求，尽管多数时候这不是必须的。 2.2.4展开系统的饱和 一般使用的是双槽的展开缸，一槽用来放展开
31、剂，另一槽可加入氨水或硫酸。把待展开的板放入两槽间的平台，斜架着，盖上展开缸的盖子。让展开剂的蒸气充满展开缸，并使薄层板吸附蒸气达到饱和，防止边沿效应，饱和时间在半个小时左右。展开时难免要打开盖子把薄层板放入展开剂中，不过对薄层板与蒸气的吸附平衡影响不大，当然动作应该尽量轻、快,2.2.5温湿度的控制 温湿度对薄层影响都很大。不冻结的前提下，通常温度越低分离越好，较难的分离需在低温下分离，例如人参皂苷。湿度的影响，估计主要是影响薄层板的吸附能力，导致选择性（容量因子）的变化，湿度应根据实际情况确定。温度控制使用空调器或冰柜，湿度控制是通过在另一展开槽放置相应浓度的硫酸。 2.2.6显色 喷显色
32、剂显色最重要是有好的雾化器。 3. 样品点样 31点状点样和条带状点样 每次点样前，TLC/HPTLC板应在正常光线下和紫外灯下用肉眼检查薄层的损伤情况和杂质，只有无损伤、清洁的TLC/HPTLC板方可使用。样品可进行点状或条带状点样。要想获得最佳的薄层分辨率，必须保证移行方向中的起点要小，常规的TLC薄层点状点样每次点0.5至5微升，相比之下，HPTLC薄层最大点样量为1l。点样量较大的样品可使用自动化装置点样，喷雾成条带状是一种可以点样量大而同时又能促成最有效分离的点样方法。在常规操作过程中，人工点样一般使用微量毛细管（0.5/1/2/3和5 l），点样时毛细管必须完全充满和完全排空，要以
33、垂直方向小心接触TLC/HPTLC板面，不要损伤薄层，受损的薄层会导致溶剂不规律地流动而在色谱上产生失真的TLC谱带。,3.2 样品点样位置 起点的最佳位置距侧边2.0cm。起点下缘的最小距离点样基线距底边2.0cm。两个起点之间的距离必须令平行移行的主成份不会相互触及。点状点样时原点的直径应小于或等于3mm（高效板原点的直径应更小）,条带的长度由点样样品体积或样品的种类和相对于板的尺寸点样的数目来决定。到板侧边的距离必须足够大以避免分离区失真变形。 4.层析 4.1展开室 4.1.1直立式双槽展开室 具有节省溶剂、便于预平衡、可控制展开箱内的湿度等优点 4.1.2 水平展开室 可以从薄层板的
34、两侧向中间水平地展开，这样可使一块薄层板所承受的样品个数比常规上行展开的薄层板增加一倍。 4.1.3 自动展开室(AMD) 可使用五种溶剂对同一薄层进行多次展开，自动控制预饱和、展开方式、展开距离和干燥条件，分离效率比传统方式提高三倍（可在80mm之内分离40种成分），符合GLP/GMP要求。 4.2. 溶剂 使用的溶剂必须是“分析纯”或“色谱纯”，溶剂组成采用体积量比（如正丁醇 - 冰乙酸 - 水 = 4：1：1，V/V/V），或者绝对量（如18ml甲苯 + 2 ml甲醇）。其总量应足以使TLC/HPTLC板的浸入深度约为5mm。展开剂要求新鲜配制，不要多次反复使用,如需分层，则按要求放置分
35、层后取需要的一相（上层或下层），备用。,5.参数 5.1温度 薄层色谱分析一般在室温中进行。在这过程，温度在20 - 25C算不上是临界值。在这过程中无短期的温度波动才是更为重要（避免抽风）。展开室应放置在无直射阳光和不通风处。温度波动对层析结果不利，故将展开室放在靠近窗口或热源处是欠妥的。 5.2空气湿度 空气湿度极高或极低主要影响有非极性溶剂体系的无机涂层。相对空气湿度高于70-80%会影响薄层钝化，使Rf值增加。样品点样后，TLC薄层可置放在适当的硫酸和水的混合物的上面不少于30分钟，调整至指定的相对湿度。有关这方面的更多资料可从HPTLC Vario系统的操作手册中获得。 另一方面，在
36、样品点样前，TLC/HPTLC板可在105C再活化30分钟进行干燥。然后薄层必须用一块玻璃板保护起来，只有起点区露出以便于样品点样。 若空气太干燥，可在干燥器中将TLC/HPTLC薄层置于水的上方以达到所要求的状况。 确定合适的层析条件的有效方法（用规定的湿度，溶剂蒸汽或溶剂调整使薄层达到要求的状况）是使用HPTLC Vario体系。 控制相对湿度用的硫酸溶液下表： 相对湿度 所需硫酸浓度（V/V） 硫酸（ml） + 水（ml） 32%47%42%58%65%72%88% 68.0 100 50.0 100 57.0 100 39.5 100 34.0 100 27.5 100 10.8 10
37、0,6 层析后衍生作用 若层析板分离的物质肉眼看不见又不能被紫外光活化，需加试剂 方能显色或发射荧光者，则需使用适当的试剂浸渍或均匀喷洒于薄层板面上，直接观察或加热显色后观察。加热显色者须注意加热时间和温度，尤其含羧甲基纤维素钠的薄层板，加热温度过高或时间过长，容易引起板面的焦化，如用硫酸等显色剂更易造成板面的炭化而影响显色效果。有的成分加试剂后，如挥发油成分经香草醛硫酸显色，加热温度和时间长短不同或放置时间不同均可能使斑点的显色有所改变。 有的品种可熏以试剂或试液的蒸气（如碘蒸气、氨蒸气）显色。 6.1 喷雾 试剂溶液以气溶胶的形式均匀地喷洒在薄层上。电动的TLC喷雾器用最少的试剂溶液产生几
38、近理想的气溶胶。 6.2 浸渍 使用适当的设备如色谱浸渍设备III（Chromotogram Immersion Device III）,TLC/HPTLC板浸渍具有重现的结果。通过设定垂直方向速度（进入，抽出）和规定停留时间，浸渍条件可被精确地标准化。,7检测 7.1 定性分析（同一性试验）在相同的状态下（相同类型的TLC/HPTLC板、相同的溶剂体系组成、相同的组份点样体积和其它TLC设备系统），样品成份的Rf值、颜色、与专用的或特殊基因衍生化试剂的反应和参考物或标准物在同一TLC/HPTLC板同时层析所得的结果相符时，未知物就可认为是存在而被鉴别出来。分析的结果可以采用照片，照片复制品，
39、影像记录（如：CAMAG 薄层色谱数码成像系统）或TLC扫描仪方法记录下来。 为增加测试物与参照物同一性的可信度，采用TLC扫描仪实时记录其紫外光和可见光图谱并进行比较。 7.2 定量分析 （仪器：CAMAG scanner-3；具体操作请参考操作手册或教学软件） 定量分析采用光密度扫描法来评价。用winCATS 软件控制薄层色谱扫描仪以及进行扫描结果的数据处理，计算出各成分的峰高和峰面积及其平均值和离散系数（CV）。通过单水平或多水平校准计算出结果。最后以报告形式将所有扫描参数、原始资料及图像结果保存及打印。 扫描狭缝宽度根据被测成份斑点的大小来调整（1）点状点样得到TLC中各成份，扫描其全
40、宽度；（2）条带状点样，通常可以扫描其色谱带同心部分的50 - 70%。 物质的扫描波长可以通过光谱扫描来决定。 TLC/HPTLC板空白部位的漫射反射光用光电倍增器（PM）来收集并定其值为10% 。扫描吸光物质时，其吸收随着物质的量而增加。 对于具有荧光或可转变成具旋光性衍生物的物质的测定。光源一般使用发射光谱在254 - 578 nm之间的高压汞蒸汽灯，在254，302，313，366，405，436，546和578nm处有特别高强度的谱线。吸收了选择性激发波长后TLC中各成份发射出的较长波长荧光由光倍增器记录下来，使用锐截止滤波器或窄带滤波器将会阻止TLC/HPTLC板反射的激发波长光到
41、达光电倍增器。和吸附测定一样，荧光强度作为板上定位的函数作图得模拟曲线（荧光定位曲线）。TLC扫描仪的测定原理在有关的设备文献中有报导。 荧光测定比吸收测定优越在于如下几点：（1）检出极限低1 - 3个数量级；（2）在较宽的浓度范围内校准曲线呈线性；（3）选择性较高。,8.影响薄层色谱分析的因素 （）样品的预处理及供试液的制备 制备样品供试液所用的溶剂溶解度不宜太大，粘度不宜太高，沸点适中。如一捻金中人参二醇及人参三醇的鉴别，若用稀酸水解后直接用氯仿萃取，点样层析，色谱因大黄成分干扰，斑点很难辨认，经碱性氧化铝小住吸附净化后，除去了大部分干扰，结果色谱清晰，人参二醇及人参三醇很容易辩认。 （）
42、薄层色谱的点样技术 点样是薄层色谱分析非常关键的步骤。它既关系到能否得到可以重新的有良好分离度的薄层色谱，也关系到定量测定结果的准确。 （）吸附剂的活性与相对湿度对薄层色谱的影响 （）溶剂蒸气在薄层色谱中的作用 应注意：预平衡、预饱和、完全饱和三者的区别 只需要展开剂的蒸气在展开箱中预平衡一定时间，称预平衡 预吸附：薄层板的干燥板面对展开箱空间气体分子的任何程度的吸附称预饱和 吸附饱和：薄层板的干燥板面与展开箱的饱和气体空间达到平衡状态 称完全饱和 （）薄层色谱的优化及溶剂系统 （）温度对薄层色谱的影响 （）影响薄层色谱的其它因素 操作技巧和熟炼程度以及所有的器材、溶剂、试剂等的质量。,高效液
43、相相关知识 一、HPLC应遵循几条原则 1、一次性原则：当系统出现了故障，可试探地改变某些状态，一次改变一个参数。例如限制峰拖尾问题，可依次改变流动相 换保护柱 换分析柱。 2、二次比较原则：动手之前已经找到解决方法。例如在进样过程中发现内标物的峰度值低，可重新进样，如果是偶然变低，是否定量管里进了气泡。此规则可用于考察系统改变后的情况。更换了流动相后在正式进样前可测定两次标准品以检查保留时间的稳定情况和色谱峰的稳定性。 3、取代规则：用好的部件换下可疑的部件，是查找故障的最好方法。 4、换回规则：此规则和取代规则一起运用，好部件取代可疑部件后情况并未得到改善，应重新换上原部件。这条规则仅适合
44、单一的故障。换回规则不适应于以下情况： （1）取下是新部件易损坏（如泵密封圈）； （2）部件价格低（如柱内衬过滤片） （3）重新装上原部件要冒损坏的风险； （4）定期更换的部件。,5 参考条件规则：通常由两种参考条件（1）标准参考条件（2）试验参考条件。标准参考条件也叫标准试验条件。是从一个系统到另一个系统易于验证的条件。试验参考条件适用于检查正常系统每天的工作情况。每天可以打印两张校正用色谱图作对照，检查保留时间，峰宽、系统压力等方面的变化。发现峰的斜率、色谱柱塔板数和其他参考值与原来色谱图相比有了变换，系统运行中可能发生了问题。 6 记录规则：在每次维护和故障排除后都做记录。每台仪器都应备
45、有维护纪录本，内容包括日期 故障部位 现象 产生的原因，解决的方法和结果等。试过的或换下的部件都要贴上标志。 7 预测原则 平时多保养，系统会减少故障，消除连锁性地损坏。例如：因平时不注意保养，泵的密封圈坏了，造成流动相渗漏，会腐蚀泵和其它部件。每天开始工作或结束工作时发现灯寿命引起基线漂移时换灯，以免停机造成损失。 8 缓冲液规则：停机时一定要洗净系统中的缓冲物。系统中缓冲液的残留会造成腐蚀，磨损和阻塞。理想的冲洗液是不含缓冲物的相同组成的流动相。不要让纯水贮藏于系统中，以防生长细菌。冲洗程序：纯水冲洗3060（ml min）再用甲醇冲洗30分钟后关机。千万不能一开机就用有机溶剂冲洗。否则无
46、机盐就会沉淀在系统中，造成不良后果。,二、HPLC故障的预防 1 、可以定期更换密封垫圈（预防性的保养）；系统常因为保护柱问题而产生压力升高，一旦发现系统压力升高，就可以换上新的保护柱（预防故障发生）。 2、 记录的建立：（1）系统使用记录（2）色谱柱记录（3）个人实验记录或测定样品记录。虽然我们不可能完全预防故障的出现，但可以减少因此而造成的麻烦，每次实验在系统记录本上都要有仪器状况与维护记录。 (1)系统使用情况： A系统中各组件的商品牌号，型号，系列号，购进日期，安装日期，每个组件的许可证信息（自动进样器 泵 色谱柱 检测器 数据处理装置等）。 B.依照表13的标准条件测量标准参数和标准
47、色谱图。要注意流动相 流速 压力 温度 检测器的参数 样品量等。,C、使用记录：日期 工作内容 开机时间 样品数 仪器性能评价 操作人员。 D、维护纪录：日期 原因 修理人员 修理结果 E、换色谱主：牌号 种类 尺寸 系列号 ；与前一根柱子的标准参考色谱图比较。 F、换部件：日期 原因 型号 系列号；做一次标准参考色谱图比较。 （2）色谱柱记录 A、种类 牌号 系列号 启用日期 按照商家提供的标准参考条件测试记录，注意样品 流动相 流速 压力 N值（色谱塔板数） t0 (纯流动相流过柱的时间，也称死时间) TR(组分离开柱时间) Rs(分离度) As(色谱峰不对称因子)。 B、使用记录：仪器
48、样品种类 数量 操作人员。 C、贮藏记录：保存溶剂（绝对禁止用缓冲液）是否加保护盖，报废后是否重新又使用过。 D、维护纪录：日期 原因 措施（例如反冲 烧结板的置换）维护人员。 E、对色谱柱的重新评价（如果需要）:按厂家规定的标准条件 操作人员。 F、使用总结：色谱柱的寿命（以月计）分析样品数目 损坏原因 对于延长寿命的建议。,编写记录是为了查询柱的使用经历，操作人员可以由此推断出色谱柱损坏的原因系统造成的损坏 实验程序有误 流动相不合适 样品的污染，以及操作者的经验等。调整好系统，完善分析系统，培训操作人员，以尽可能地延长色谱柱的寿命。 （3）个人实验记录：可以帮你了解使用溶剂的批号，对色谱分析的影响；了解纯化水系统工作是否正常，结合色谱柱记录，可以清楚地了解色谱柱使用情况以及其他原因造成色谱主地失效。 A、操作条件：流动相的配制（包括体积 ph 过滤 贮存等）流速 温度 检测器 各种设定的操作程序。 B、样品处理的方法。 C、分析实验程序 包括样品体积 选用标准 执行程序。 D、数据处理程序。 E、分析结果和报告 各种数据 资料 色谱图。 F、实验现象的观察结果 G、仪器设备的各种唯一性标识（同上述两种记录） 给出几种典型的记录格式。,三、 HPLC日常为维护 1、贮液器：尽可能使用HPLC的溶剂和试剂。含有缓冲