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1、天然药物化学,遗传与细胞研究所 教育部农业与医药基因工程研究中心 孟祥颖 200809,（二）分离纯化法 分离：是将混合物按极性大小、酸碱性程度或其它性质而分成若干部位或含有相同结构类型的若干类成分的操作，通过几次分离操作可以得到较纯的化合物。 精制：是分离单一化合物的最后一部操作，就是把留存在单一化合物中的少量杂质分离的过程。,（二）分离纯化法,1、系统溶剂分离法 一般是将上述总提取物，选用三、四种不同极性的溶剂，由低极性到高极性分步进行提取分离。,水浸膏或乙醇浸膏常常为胶状物，难以均匀分散在低极性溶剂中，故不能提取完全，可拌入适量惰性填充剂，如硅藻土或纤维粉等，然后低温或自然干燥，粉碎后，
2、再以选用溶剂依次提取（如用索氏提取器依次提或上硅胶柱依次洗脱），使总提取物中各组成成分，依其在不同极性溶剂中溶解度的差异而得到分离。,（二）、分离纯化法,1、系统溶剂分离法,例如：某药材的70% 乙醇的提取物浸膏 拌硅燥土后的干粉装于滤纸桶中 石油醚提取 或 乙醚提取 （氯仿提取 或）乙酸乙酯提取 正丁醇提取 甲醇或乙醇提取 水煮提,（二）、分离纯化法,2、两相溶剂萃取法,（1）简单萃取法,是利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的方法。 萃取时如果各成分在两相溶剂中分配系数相差越大，则分离效率越高。 K=(k1-k2) K=C1/C2 萃取中一定要注意防止乳化产生。
3、,（二）、分离纯化法,（2）连续萃取法,是一种连续的两相溶剂萃取法。,（二）、分离纯化法,（2）连续萃取法,（二）、分离纯化法,（3）逆流分配法,逆流分配法又称逆流分溶法、逆流分布法或反流分布法。逆流分配法与两相溶剂逆流萃取法原理一致，但加样量一定，并不断在一定容量的两相溶剂中，经多次移位萃取分配而达到混合物的分离。,（二）、分离纯化法,（3）逆流分配法,（二）、分离纯化法,（4）液滴逆流分配法(DCCC),液滴逆流分配法又称液滴逆流层析法。,对溶剂系统的选择基本同逆流分配法，但要求能在短时间内分离成两相，并可生成有效的液滴。由于移动相形成液滴，在细的分配萃取管中与固定相有效地接触、摩擦不断形
4、成新的表面，促进溶质在两相溶剂中的分配，故其分离效果往往比逆流分配法好。且不会产生乳化现象，用氮气压驱动移动相，被分离物质不会因遇大气中氧气而氧化。,（二）、分离纯化法,（4）液滴逆流分配法,N2气驱动,（二）、分离纯化法,沉淀法是向提取液中加入某些试剂，使欲分离的成分沉淀或使杂质沉淀的方法。,3、沉淀法,（二）、分离纯化法,3、沉淀法,（1）铅盐沉淀法： 铅盐沉淀法为分离某些中草药成分的经典方法之一。 中性醋酸铅和碱式醋酸铅为沉淀试剂。 由于中性醋酸铅及碱式醋酸铅在水及醇溶液中，能与多种中草药成分生成难溶的铅盐或络盐沉淀，故可利用这种性质使有效成分与杂质分离。,中性醋酸铅Pb(Ac)2可沉淀
5、的成分 a. 含羧基-COOH的酸性成分：如有机酸、蛋白质、氨基酸、酸性多糖、酸性树脂、酸性皂苷等。 b.具有邻二酚羟基的酚酸性成分，如部分黄酮、蒽醌及鞣质等。 碱式醋酸铅Pb(OH)Ac可沉淀的成分 a.上述成分 b.一元酚类、中性多糖、某些中性皂苷、某些异黄酮及其苷、某些生物碱、某些低聚糖和单糖等。,（1）铅盐沉淀法：,通常将中草药的水或醇提取液先加入中性醋酸铅浓溶液，静置后滤出沉淀，并将沉淀洗液并入滤液，于滤液中加碱式醋酸铅饱和溶液至不发生沉淀为止，这样就可得到中性醋酸铅沉淀物、碱式醋酸铅沉淀物及母液三部分。,（1）铅盐沉淀法：,注意：对铅盐沉淀物要进行脱铅处理。 （2）酸碱沉淀法(碱溶
6、酸沉淀法或酸溶碱沉淀法） 利用酸性成分及内酯成分能溶于碱水，加酸沉淀析出；或利用碱性成分能溶于酸水，加碱沉淀析出的方法。 如生物碱加碱游离溶于有机溶剂，在水中则沉淀；加酸成盐溶于水。,（3） 乙醇沉淀法 在浓缩的水提液中，加乙醇使醇含量达80% 以上，则难溶于高浓度醇的成分沉淀（如淀粉、菊糖等多糖和蛋白质） 。 （4）专一试剂沉淀法 利用某类成分能和特定试剂产生沉淀而和其他成分分离的方法。 如：生物碱 H+ 生物碱盐 生物碱沉淀试剂 沉淀 恢复生物碱原型,（二）、分离纯化法,盐析法是在中草药的水提液中加入无机盐（常用NaCl、Na2SO4等）达到一定浓度或达到饱和状态，使水溶性较小的成分沉淀析
7、出，而与水溶性较大的成分相分离的方法。,4、盐析法,（二）、分离纯化法,5、结晶（重结晶、分步结晶）,利用固体混合物对某种溶剂的溶解度差别，而使单一成分以结晶状态析出的方法。,（二）、分离纯化法,6、透析法,透析法是利用小分子及小离子物质在溶液中可以通过半透膜，而大分子及大离子不能通过半透膜的性质，从而达到相互分离的方法。 例如分离纯化皂苷、蛋白质、多肽、多糖等大分子成分时，可用透析法除去小分子如无机盐、单糖、双糖等杂质。,（二）、分离纯化法,7、分馏法,对于完全能够互溶的液体混合物的分离可采用分馏法。 分馏法是利用液体混合物中，各单一成分的沸点（bp.）的不同而达到分离目的的方法。,（二）、
8、分离纯化法,8、超速离心法,是利用各化合物分子大小的不同在超速离心条件下有不同的沉降速度得以分离的方法 。,（二）、分离纯化法,9、超滤法,膜分离技术按被分离物质相对分子量的大小分为微滤(0.1)、超滤(10100)、纳滤(110)和反渗透(1)。 中药领域主要应用微滤和超滤两种方法。,（二）、分离纯化法,微滤处理中药水溶液，可除去大量亚微粒、微粒及絮状沉淀，为超滤提供可靠的预处理。 超滤可除去药液中的淀粉、树胶、果胶、粘液质、蛋白质等可溶性大分子杂质和微生物及部分热原。,9、超滤法,（二）、分离纯化法,超滤法原理 近似机械筛，当溶液体系经由水泵进入超滤器时，在滤器内的超滤膜表面发生分离，溶剂
9、(水)和其它小分子量溶质透过具有不对称微孔结构的滤膜，大分子溶质和微粒(如蛋白质、病毒、细菌、胶体等)被滤膜阻留，从而达到分离、提纯和浓缩产品的目的。,9、超滤法,超滤与普通过滤的区别,(二)、分离纯化法,名称 孔径 孔结构 分离对象 反复使用 普通过滤 微米级 直孔 固-液 不能 超滤 20-500A 不对称孔 液-液 能,(二)、分离纯化法,超滤技术的主要特点是: 结构紧凑； 操作方便； 能耗低； 有效膜面积大； 分离效率高； 可在常温下进行操作； 对分离热敏性、保味性的药物更为适用。,超滤法较传统方法的优势,(二)、分离纯化法,超滤法的其它优势,(1)减少工序，缩短生产周期，不耗用有机溶
10、媒，有利于工厂的安全生产，并减少环境污染。 (2)较醇沉法能更有效地保持原配方的成分，且提高了有效成分的含量。 (3)去杂质效果好，明显提高了注射液和口服液的澄明度及储存稳定性。 (4)除热原效果好，可达到药典要求。 (5)除菌效果好，避免了有些药液因加热灭菌而产生絮状沉淀。,(二)、分离纯化法,10、色谱分离法（层析法）,色谱法是利用不同的物质在固定相和流动相中不同的平衡分配系数来进行分离的一种方法。,(二)、分离纯化法,色谱法按两相的状态分为： 液相色谱（流动相为液体）和 气相色谱（流动相为气体）。 液相色谱又分为 液-固色谱和 液-液色谱； 气相色谱又分为 气-固色谱和 气-液色谱。,色
11、谱法的分类,(二)、分离纯化法,色谱法按机理分类（色谱的主要分类方法）,色谱柱名称 层析的原理 吸附色谱 物理吸附 （范德华力作用） 分配色谱 分配原理（分配系数） 离子交换色谱 离子交换 凝胶色谱 分子筛作用 聚酰胺色谱 半化学吸附（氢键作用） 大孔吸附树脂 物理吸附、氢键吸附和分子筛作用 气相色谱 吸附和分配原理 高效液相色谱 吸附和分配原理,液相色谱发展史,1906 - Mikhail Semenovich Tswett (1872-1919),碳酸钙吸附剂,石油醚洗脱剂,1940s - 分配色谱和纸色谱,1950s - 气相、 薄层、凝胶过滤色谱 、,梯度洗脱色谱,1960s - 商业
12、高效液相色谱.,(二)、分离纯化法,（1） 吸附层析法,吸附层析法的原理：利用混合物中各组分对固体吸附剂（固定相）吸附能力的不同而达到分离的层析方法。 吸附剂：常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、氧化镁等。 物理吸附：无选择性，吸附与解吸可逆。,吸附层析是由： 吸附剂、 洗脱剂、 被分离的样品三部分构成的。,(二)、分离纯化法,吸附剂 极性吸附剂（ 如硅胶、氧化铝) 极性强，吸附力大(洗脱时洗脱力随洗脱剂的极性增强而增大)。 非极性吸附剂 (如活性炭-对非极性化合物的吸附力强(洗脱时洗脱力随洗脱剂的极性降低而增大)。,（1） 吸附层析法,(二)、分离纯化法,（1） 吸附层析法,氧化铝（
13、Al2O3 ）适合分离脂溶性成分（如：生物碱 、甾体和挥发油 ）。 硅胶(SiO2 XH2O)适合分离水溶性和脂溶性成分。 活性炭适合水溶性成分的分离，如氨基酸、糖和苷的分离。,硅胶和氧化铝的吸附能力与含水量有关。一般用前要活化。 含水量低、活性高，吸附力强。 含水量高、活性低、吸附力弱。 氧化铝活化要在马弗炉中400、6小时，得级氧化铝。 硅胶活化要在100110 、0.51小时。,(二)、分离纯化法,吸附力大小是依据“相似者相溶” 的原理；根据化合物吸附力大小的不同达到分离（与化合物的极性相关。),被分离的样品: 化合物的吸附力,(二)、分离纯化法,洗脱剂: 用单一溶剂或混合溶剂。 一般是
14、由低极性溶剂到高极性溶剂。,(二)、分离纯化法,吸附层析的操作,操作方式：吸附柱层析： 干法装柱 湿法装柱 吸附薄层层析,a.装柱 样品：吸附剂 Al2O3 为 1 : 20 50 （极性小的可 1 : 100）， 样品：吸附剂 SiO2 为 1 : 30 100 （ 极性相近的可 1: 300 400） 层析柱规格 1 : 10 30（直径 : 高度） 原则 ： 均匀、致密，无气泡、无缝隙。 ( 1 ) 干法装柱 ： 底部塞脱脂棉，敲击，顿击。与TLC吻合度较好，溶剂消耗少，需加压洗脱。 ( 2 ) 湿法装柱 ： 倒入溶剂后，加吸附剂； 吸附剂与溶剂 搅拌后，倒入柱中。均匀，前沿整齐。,干法
15、装柱,湿法装柱,柱分离,吸附柱层析 b.上样 1) 干法 干法上样 2) 湿法 溶剂溶解上样（少量）,(二)、分离纯化法,吸附柱层析,c. 洗脱 分常压、低压（减压）、加压 d.收集与检查 收集分等份收集或按色带收集 TLC检查 。,(二)、分离纯化法,（2）分配层析法,其原理是依据液-液萃取的原理。 利用混合物中各成分在互不相溶的两相溶剂中分配系数的不同而达到分离。其组成上比吸附层析多一个支持剂，使固定相吸着在支持剂上。,分配层析是将互相饱和的一相溶液吸着于某种惰性固体粉末或滤纸上，这一相成为固定相，这种吸着了固定相的物质称为支持剂（或载体或担体）。被分离的物质置于固定相上（包括载体），以另
16、一相即移动相洗脱或展开，样品中的物质就在固定相与移动相之间分配而达到分离。,（2）分配层析法,分配层析是由载体、固定相、移动相和被分离的物质四部分组成的。 A. 支持剂（载体） 常见的有：硅胶（含水量达17%以上时作支持剂）、硅藻土、纤维素粉、滤纸（纤维）。,B 固定相和移动相 分配层析又分为： 正相分配层析（固定相的极性大于移动相的极性） 反相分配层析（固定相的极性小于移动相的极性） C. 被分离的物质 依相似者相溶的原理达到分离。,分配层析的操作分三种形式： 纸层析 分配薄层层析 分配柱层析,主要讲一下纸层析（Paper Chromatography） 纸层析是以滤纸作为支持剂的一种分配层
17、析法。 水饱和的滤纸含水量为20%35%。干燥的滤纸总是吸着其自身重量约6%7%的水分，这部分水是以氢键的形式与滤纸纤维素上的羟基结合，而在一般情况下较难以脱去的。,纸层析的分离对象 纸层析特别适合于水溶性成分如氨基酸、糖、苷类、有机酸等的分离和鉴定。,纸层析的操作： 1. 样品液的配制 2.点样（毛细管点样、距底边1.52cm作为原点或起始点，斑点直径不超过23mm,点样量要适量，视样液浓度而定，不能过多或过少) 3.展开：滤纸条悬挂于密闭的缸底部盛放展开剂的层析缸内（注意：展开后一定要标记前沿）。,4.斑点的定位方法 化合物本身有色，直接观察。 化合物本身无色但有荧光，看荧光。 用显色剂显色 ，看待色斑点。 a.通用显色剂 b.专属性显色剂 5.斑点位置的表示方法 Rf= a/b Rf：0.20.8较合适 注意H2SO4、I2不可用，与纸产生作用。,a,b,举例：纸层析实验 样品液：葡萄糖的95%乙醇液和鼠李糖的 95%乙醇液。 展开方式：径向展开 展开剂：n-BuOH : HAc :H2O (4:1:5 上层) 即正丁醇：冰醋酸：水(4:1:5上层) 显色剂：苯胺邻苯二甲酸,D-glucose,结构式：,实验结果如下，试分析两化合物斑点的归属。,黄柏的TLC,山豆根 TLC,罂粟壳TLC,再见！,