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1、一、紫外可见光分光光度法,光谱分析法,二、荧光分析法,基本原理,仪器主要部件,紫外-可见光分光光度法,主要应用,基本原理,概述：紫外-可见分光光度法是通过被测物质在紫外-可见光区的特定波长或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。主要用于药品的鉴别、检查和含量测定。 范围：,可见光区（400760nm）,紫外光区（200400nm）,Beer-Lambort 定律,*A为吸收度； *T为透光率； *E为吸收系数（以 表示，溶液浓度为1%（g/ml），厚度为1cm时的吸光度值） *c为溶液浓度； *l为样品总厚度。,适用条件：,入射光为单色光 溶液是稀溶液 固体、 液体和气体
2、样品在同一波长下，各组分吸光度具有加和性,仪器主要部件,光 源: 常采用氘灯和钨卤灯 钨灯最适宜的使用波长范围为3201000nm。 氘灯能发出光的波长范围一般为190400nm 单色器：棱镜或光栅 吸收池：玻璃或石英吸收池 检测器：光电池、光电管、光电倍增管及二极管阵列检测器,仪器分类,单光束紫外可见分光光度计 准双光束紫外可见分光光度计 双光束紫外可见分光光度计 双波长紫外可见分光光度计,主要应用,利用药物与杂质对光的选择性吸收性质的差异，若药物在杂质的最大吸收波长处没有吸收，则可在此波长处测样品溶液的吸收度，通过控制样品溶液吸收度来控制杂质的量。 例：地蒽酚中二羟基蒽醌的检查 二羟基蒽醌
3、的三氯甲烷溶液 在432nm处有最大吸收，而 地蒽酚在该处几乎无吸收。,1、药物的杂质检查,2、药物的含量测定,如巴比妥类药物的含量测定（巴比妥类药物在碱性介质中电离为具有紫外吸收特征的结构）、芳酸及其脂类药物含量测定、维生素A含量测定（在325328nm的波长范围内有最大吸收）等。,三点校正法 本方法是在三个波长处测得吸光度，根据校正公式计算吸光度校正值后，再计算含量。其原理主要基于以下两点： 杂质的无关吸收再310340nm的波长范围内几乎呈一条直线，且随波长的增大吸光度下降。 物质对光吸收呈加和性的原理，即在某一样品的吸收曲线上，各波长的吸光度是维生素A与杂质吸光度的代数和，因而吸收曲线
4、也是二者吸收的叠加。,3、药物的鉴别,对比吸收光谱特征数据 对比吸收度（或吸收系数）的比值 对比吸收光谱的一致性,例 苯磺舒：用含盐酸的乙醇取盐酸溶液（9-1000）2ml，加乙醇制成100ml制成没1ml中含20ug的溶液，在225nm与249nm的波长处有最大吸收，在249nm波长处的吸收度为0.67 。 甾体激素类药物：丙酸倍氯米松的乙醇溶液（20ug/ml），在239nm的波长处应有最大吸收，吸光度为0.570.60;在239nm与263nm波长处的吸光度比值应为2.252.45,1.判别物质的异构体，如互变异构体，顺反异构体，开链和成环异构体，旋光异构体，空间异构体等。反式异构体空间
5、位阻小，共轭程度较完全。最大吸收峰波长，最大摩尔吸收系数，大于顺式。 2.推测物质的共轭体系和部分骨架 一般需与色谱，红外，质谱，波谱等多种仪器联合作物质的结构分析。,4.结构分析,紫外分光光度测定方法,普通测定分光光度法 1.单组分的测定 通常采用 A-C 标准曲线法定量测定。 2.多组分的同时测定 若各组分的吸收曲线互不重叠，则可在各自最大吸收波长处分别进行测定。这本质上与单组分测定没有区别。 若各组分的吸收曲线互有重叠，则可根据吸光度的加合性求解联立方程组得出各组分的含量。 A1= a1bca b1bcb A2= a2bca b2bcb,差示分光光度法,普通分光光度法一般只适于测定微量组
6、分，当待测组分含量较高时，将产生较大的误差。需采用示差法。 即提高入射光强度，并采用浓度稍低于待测溶液浓度的标准溶液作参比溶液。 设：待测溶液浓度为cx，标准溶液浓度为cs(cs cx)。则： Ax= b cx As = b cs x s =b(cx cs ）=bc 测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与标准溶液的吸光度之差。示差法测得的吸光度与c呈直线关系。由标准曲线上查得相应的c值，则待测溶液浓度cx ： cx = cs + c,双波长分光光度法,不需空白溶液作参比；但需要两个单色器获得两束单色光(1和2)；以参比波长1处的吸光度A1作为参比，来消除干扰。在分析浑浊或背景吸收较大的复杂试样时
7、显示出很大的优越性。灵敏度、选择性、测量精密度等方面都比单波长法有所提高。 A 2 A 1 （2 1 ) b c 两波长处测得的吸光度差值与待测组分浓度成正比 （例子：课本366页）,导数分光光度法,导数分光光度法在多组分同时测定、浑浊样品分析、消除背景干扰、加强光谱的精细结构以及复杂光谱的辨析等方面，显示了很大的优越性。 利用吸光度(或透光度)对波长的导数曲线来进行分析： 0 e-bc 假定入射光强度0 在整个波长范围内保持恒定： dI 0 /d0 则：dI/d0 bc e -bc d/d 0 bc d/d （例子：课本233页）,其他,卡尔曼滤波法 偏最小二乘法 小波变换 三波长分光光度法
8、 系数倍率法 ,与紫外-可见法异同点,应用,荧光分析法,原理,原理,荧光分子吸收电磁波后，从其最低激发态重新发射紫外线或可见光的现象 利用某些物质被一定波长的光照射后所产生的，能够反映该物质特性的荧光来进行定性定量的分析方法荧光分析法。,在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,光照 分子基态 激发态 辐射跃迁 荧光 若光源是： 由荧光波长可确定物质分子 可见-紫外光源 分子荧光分析法 具有结构 由荧光强度可测物质的含量 原子特征光谱作光源 原子荧光分析 X射线作光源 X射线荧光分析,构件,光源 ： 为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较
9、大的连续光谱，且在300nm400nm 范围内强度几乎相等，故较常用 。 激发单色器 ： 置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。 发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。筛选出特定的发射光谱 样品室： 通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。 检测器： 一般用光电管或光电倍增管作检测器。可将光信号放大并转为电信号。,荧光分析法与紫外-可见分析法异同点,荧光分析法与紫外-可见比较： 均属于分子光谱 仪器构造 基本相似 荧光 可见-紫外 本质 发射光谱 吸收光谱 灵敏度 10-10-10-12 g/ml
10、 10-4-10-7g/ml 选择性 高 一般,应用,硫色素荧光法测定维生素B1 维生素B1 在碱性溶液中被铁氰化钾氧化成硫色素，在紫（365nm）照射下呈蓝色荧光（435nm）通过与对照品荧光强度比较。即可测得供试品含量（课本260页） 荧光分光光度法测定维生素E 采用同步荧光扫描法测定血清中维生素E，有效的消除溶剂拉曼光谱的干扰，提高灵敏度和准确性。（课本277页）,时间分辨荧光光谱 基于不同发光体发光衰减速度不同.寿命不同.在进行这种测量时要求带有时间延迟设备的脉冲光源和带有门控时间电路的检测器件,从而可在固定延迟时间td和门控时间tg,用发射单色器进行扫描.可得到时间分辨发射光谱。 同步扫描 根据激发光和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系,参考文献,刘文英，药物分析. 袁观宇，生物物理学. 李昌厚，紫外分光光度计. 陈 伟,林新华.紫外-可见分光光度法新技术在药物分析中应用的进展.Journal of Fujian Medical University .2001;35:300-303. 王 雷, 杨新建, 寇 欣. 紫外分光光度法在中药分析中的应用进展. 天津药学.2003;第15卷第5期,