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1、实验九、十 微生物的生理生化反应,糖发酵试验 吲哚试验 产硫化氢试验 vp试验 甲基红试验 淀粉水解试验,一、目的要求,1.了解细菌的一般生化反应； 2.了解细菌的生化鉴定方法其原理。,二、基本原理,由于各种微生物的新陈代谢类型不同，因此，对各种物质利用后所产生的代谢产物也不同，我们可以用化学反应来测定微生物的代谢产物，这种反应称为生化反应。生化反应常用来鉴别在形态或其它方面不易区别的微生物，例如：肠道细菌中，大肠杆菌和伤寒杆菌，二者在形态上不易区分，但前者能发酵乳糖，后者不能。因此可以从它们能否发酵乳糖来区别它们，所以微生物的生化反应是微生物分类鉴定的重要依据之一。,三、材料,菌种：大肠杆菌
2、；枯草杆菌；变形杆菌；自己分离的大肠杆菌。 培养基：糖发酵培养基（葡萄糖）；H2S试验用培养基；蛋白胨水培养基；葡萄糖蛋白胨水培养基；淀粉培养基。 试剂：吲哚试剂；碘液；甲基红试剂；VP试剂。,1.糖发酵试验,糖发酵试验是常用的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要，绝大多数细菌都能利用糖类作为能源及碳源，但是细菌的分解糖类的能力上有相当大的差异，某些菌能使某些单糖或双糖分解，并产酸（乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（甲烷、氢、二氧化碳），或者只产酸而不产生气体。酸和气体的产生与否，可以由培养后试管指示剂的颜色变化和小套管内气泡的有无来判定。当发酵产酸时，指示剂溴甲酚紫由紫色（pH6.8）变为黄色（p
3、H5.2）。其步骤如下：,（1）取盛有葡萄糖发酵培养基的试管四支（内装有小套管），一支接种大肠杆菌，第二支接自己分离的大肠杆菌，第三支接枯草杆菌，第四支不接种，作空白对照。在各试管上标明菌名和组别，置37培养24小时。,（2）观察结果：经培养后，指示剂呈黄色者表示为酸性，同时观察小套管中有无气泡产生。,2吲哚试验,某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸而生成吲哚。吲哚与对二甲基氨苯甲醛结合，形成玫瑰吲哚，此为红色化合物，其反应变化如下：,（1）取蛋白胨水培养基试管四支，分别接种大肠杆菌，自己分离的大肠杆菌，枯草杆菌，留一支作空白对照，并在试管上注明菌名和组别，置37培养48小时。 （2）培养后取出，在
4、培养液中先加入乙醚约1毫升（使呈明显的乙醚层），充分振荡，使吲哚溶于乙醚中，静置片刻，使乙醚层浮于培养基的上面，这时再沿管壁慢慢加入吲哚试剂510滴，观察有无红色出现。有红色环出现者为阳性，黄色者为阴性。 （注意：加入试剂后不可再摇动，否则被混合，红色不明显。）,3产硫化氢试验,某些菌能分解含硫的有机物或无机物产生硫化氢（H2S），H2S遇金属盐类，如铅盐、铁盐等，则形成黑色的硫化铅或硫化铁的沉淀物。从而可断定H2S的产生与否。其测定方法有两种，一种是用含有柠檬酸铁铵的培养基穿刺培养，看是否有黑色沉淀（本实验采用）；另一种是在盛有液体培养基的试管中接种菌以后，在试管的棉塞下吊一片醋酸铅试纸，经
5、培养后看醋酸铅试纸是否变黑。其步骤如下：,（1）取H2S试验用培养基四支（内含有柠檬酸铁铵），分别用穿刺法接种大肠杆菌，自己分离的大肠杆菌和变形杆菌，留一支空白，试管上注明菌名和组别，置37培养24小时。 （2）培养后取出观察，看有无黑色沉淀产生。,4伏一普（Voges-proskauer）二氏反应，即VP反应,某些菌生长于葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，而丙酮酸又可缩合、脱羧而转化成乙酰甲基甲醇，如加入强碱液，即与空气中的氧起作用产生二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的含胍基成分作用生成红色化合物，称阳性反应，没有红色化合物产生则称阴性反应。,（1）取葡萄糖蛋白胨水培养基四支，分别接种大
6、肠杆菌，自己分离的大肠杆菌，枯草杆菌，留一支作空白对照，并在试管上注明菌名和组别。置37培养24小时。 （2）培养后取出，按书119页上的要求加试剂后，放置37温室30分钟，呈红色者为阳性，不呈红色者为阴性。,5甲基红试验（MR试验）,某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能产生大量的酸，使pH降低至45，它先产生丙酮酸，丙酮酸再被分解成甲酸、乙酸、乳酸等。酸的产生可由加入甲基红指示剂的变色而指示（有效pH范围为4.26.3）。细菌分解葡萄糖产酸，则培养液由原来的桔黄色，变为红色，即为甲基红反应。,（1）取葡萄糖蛋白胨水培养基四支，一支接种大肠杆菌，第二支接自己分离的大肠杆菌，第三支接枯草杆菌，第四
7、支不接种，作空白对照。在各试管上标明菌名和组别，置37培养48小时。 （2）培养后取出，沿管壁加入甲基红指示剂34滴上层呈红色者为阳性。,6淀粉水解试验,某些细菌可以产生能水解培养基中淀粉的淀粉酶（胞外酶），使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，再被细菌吸收利用。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。,（1）淀粉培养基在水浴中融化后，冷至 50，以无菌操作制成平板。用接种环取 少量枯草杆菌在平板的一边划“+”字形接 种（或点种），另取少量大肠杆菌菌在平 板的另一边接种，在各培养皿底部标明菌 名和组别。置37温箱中培养1620小时。,（2）观察结果：打开皿盖，滴加少量碘液于培养基上，轻轻旋转培养皿，使碘液均匀铺满整个平板。如果在菌周围出现无色透明圈，说明淀粉被水解。透明圈大小说明该菌水解淀粉能力的大小。,四、结果与思考题,1将实验结果填于p114-120表中 （1）糖发酵试验结果：“+”表示产酸；“”-产酸产气；“-”表示阴性。 （2）其它试验结果：“+”表示阳性反应；“-”表示阴性反应。 2细菌的生化反应试验意义何在？,