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1、沙门菌检验,严纪文,沙门菌概况,沙门菌是1885年由Salmon氏等在猪霍乱流行时，分离出的猪霍乱沙门菌，由于Salmon氏对本属细菌的发现贡献卓越，故定名为沙门菌属。 沙门菌属是肠杆菌科中最重要的病原菌。它是一群抗原结构、生化特性相似的革兰氏阴性杆菌。血清型繁多，目前已发现的沙氏菌有2500多个血清型和变种。我国自1911年至90年代初已有255个血清型。,虽然沙门菌的血清型很多，但多数国家从人体、动物和食品中分离出沙门菌仅约4050个血清型。而在一个国家中的一定时期只约有10个血清型是比较常见的。 分类： 伤寒沙门菌(伤寒、副伤寒)-传染病防治法中规定报告的乙类传染病。 非伤寒沙门菌-食品
2、卫生标准的检测的主要对象。,沙门菌的生物学特性,形态与染色性： 革兰氏阴性杆菌，无芽胞,一般无荚膜。 除鸡瘟沙门菌（S.pullorum)和鸡沙门菌(S.gallinarum)外均有动力。为周身鞭毛，并多数有菌毛。 大小：13um0.51um。,营养需求不高，需氧或兼性厌氧。普通营养培养基上均能生长，能够利用柠檬酸盐作为碳源。 在普通肠道选择性平板上基本上形成无色菌落。菌落中等大小，半透明，表面光滑，边缘整齐或呈锯齿状。 不分解乳糖，大部分菌株产H2S，发酵葡萄糖产酸不产气。,培养与生化特性,最适培养温度为37，最适pH 7.27.6。 耐受胆盐，在粪便、土壤、食品、水中可生存5个月至二年之久
3、。,沙门菌的分布,沙门菌广泛存在于自然环境中。 通过沙门菌病患者或健康带菌的人和动物的排泄物污染环境和食品。 易于污染的高危食物：畜禽肉类、蛋、奶及其制品。 沙门菌在肉类中不分解蛋白质，不产生靛基质，所以当食品污染了沙门菌后，通常没有感官性状的改变。,修订内容,前增菌:取消样品分类，前增菌液统一为“缓冲蛋白胨水”。 对所有样品均进行818h前增菌。原标准只对冻肉、蛋品、乳品等加工食品进行前增菌。 修改了样品的处理方式：增加拍击式均质器，均质袋可直接培养。 样品液增加调整pH值。 选择性增菌：使用“TTB、SC”，取消“MM”。 分离培养基：使用BS、XLD、HE、科玛嘉显色培养基。取消DHL、
4、SS。,生化鉴定： 1.采纳API 20E或Vitek GNI为传统生化鉴定方法的选择性替代方法。 2.生化鉴定项目进行调整： 原国标中生化鉴定是将可疑菌落同时接种于三糖铁（TSI）琼脂、蛋白胨水 (供做靛基质试验)、尿素琼脂 (pH7.2)、氰化钾 (KCN) 培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基； 现修改为：在接种TSI琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时增加一项营养琼脂（NA），经TSI琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的选择后，可筛掉大部分非沙门氏菌株，大大减少了工作量，同时也满足了API 20E或 Vitek GNI鉴定的需要。,为保持与原标准的一致性，新标准也保留了可以同时直接接种蛋白胨水 (供
5、做靛基质试验)、尿素琼脂 (pH7.2)、KCN 培养基的内容。本部分还增加了对疑似菌落进行留样确认的部分，以备必要时复查，这对生化鉴定不确定的菌落进行进一步验证是非常必要的。 血清学鉴定中的菌体分群改为选择性试验项目。 报告：综合以上生化试验和血清学鉴定的结果,报告25g样品中检出或未检出沙门菌。,培养基的改变,旧标准 前增菌：BPW 增菌：MM(或TTB)、SC 分离培养：BS、DHL(或HE、WS、SS) 生化鉴定：生化管,新标准 前增菌：BPW 增菌：TTB、SC 分离培养：BS、XLD、显色培养基 生化鉴定：生化管、API 20 E生化鉴定试剂盒、VITEK GNI生化鉴定卡,沙门菌
6、的检验程序,检样,前增菌法 25g样品BPW225mL,818h,361,1mL检样TTB10mL,1mL检样SC10mL,BS,XLD(或HE、显色培养基),361,4048h,361,1824h,挑取可疑菌落,421，1824h,361，1824h,沙门菌的检验程序,可疑菌落,TSI（斜面、底层、产气、H2S），蛋白胨水（靛基质），尿素（pH7.2)，KCN，赖氨酸、营养琼脂(NA),H2S， 靛基质 尿素，KCN 赖氨酸,H2S，靛基质 尿素，KCN 赖氨酸,H2S，靛基质 尿素，KCN 赖氨酸/,非如左述的各种反应结果,甘露醇+，山梨醇+,ONPG,非沙门菌,血清学鉴定,报告,商品化生
7、化鉴定系统,称取25 g（mL）样品放入盛有225 mL BPW的无菌均质杯中，以8 000 r/min10 000 r/min均质1 min2 min，或置于盛有225 mL BPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min2 min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。无菌操作将样品转至500 mL锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36 1 培养8 h18h。 如为冷冻产品,应在45 以下不超过15 min,或2 5 不超过18 h解冻。,前增菌,轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1 mL, 转种于10 mL TTB 内, 于42 1 培养18 h24 h。同时, 另取1 mL,
8、转种于10 mL SC内, 于36 1 培养18 h24 h。 分别用接种环取增菌液1环, 划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或显色培养基平板）。于36 1 分别培养18 h24 h (XLD琼脂平板、HE琼脂平板、显色培养基平板) 或40 h48 h (BS琼脂平板)，观察各个平板上生长的菌落。,增菌与分离,沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征,接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白胨水 (供做靛基质试验)、尿素琼脂 (pH7.2)、氰化钾 (KCN) 培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于36 1 培养18
9、h24 h, 必要时可延长至48 h。 将已挑菌落的平板储存于2 5 或室温至少保留24 h，以备必要时复查。,生化试验,自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，分别接种三糖铁（TSI）琼脂、赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板；取菌落一部分于斜面划线和底层穿刺。 接种针在接种TSI后不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36 1 培养18 h24 h，必要时可延长至48 h。,沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果,该表显示：只有在三糖铁斜面产酸、底层产酸；同时赖氨酸阴性的菌株可排除。其他反应结果均有沙门菌属的可能，同时也均有不是沙门菌的可能
10、。,沙门氏菌属生化反应初步鉴别表,反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常, 按下表可判定为沙门氏菌。 如有2项异常为非沙门氏菌。,沙门氏菌属生化反应初步鉴别表,反应序号2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门菌靛基质阳性变体两项结果均为阳性； 反应序号3：补做ONPG，ONPG阴性，同时赖氨酸脱羧酶阳性为沙门菌；但甲型副伤寒沙门菌赖氨酸脱羧酶为阴性。,沙门氏菌属各生化群的鉴别 必要时按此表进行沙门菌生化群鉴定,沙门菌的增菌培养基,缓冲蛋白胨水(BPW) 肉汤：是基础增菌培养基，不含任何抑制成分，有利于受损伤的沙门菌复苏。使受损伤的沙门菌细胞恢复到稳定的生理
11、状态。一般用于加工食品或冷冻食品的前增菌。,沙门菌的增菌液,四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB)：含有胆盐，抑制革兰氏阳性球菌和部分大肠埃希氏菌的生长，而伤寒与付伤寒沙门菌仍能生长。 亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）：可对伤寒及其他沙门菌作选择性增菌，亚硒酸与蛋白胨中的含硫氨基酸结合，形成亚硒酸和硫的复合物，影响细菌硫代谢，从而抑制大肠埃希氏菌、肠球菌和变形杆菌的增殖。,沙门菌的分离培养基,亚硫酸铋琼脂（BS）：含有煌绿、亚硫酸铋能抑制大肠杆菌、变形杆菌和革兰氏阳性菌的生长，但对伤寒、副伤寒等沙门菌的生长无影响。伤寒杆菌及其他沙门菌能利用葡萄糖将亚硫酸铋还原成硫酸铋，形成黑色菌落周围绕有黑色和棕色的环，
12、对光观察可见有金属光泽。该培养基制备过程不宜过分加热，以免降低其选择性，应在临用时配制，超过48h不宜使用。,沙门菌的菌落形态：产H2S的菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色。菌落周围培养基可呈黑色或棕色，有些不产H2S的菌落，形成灰绿的菌落，周围培养基不变。 注：此培养基在制作过程中过分加热可使培养基的选择性降低，与TTB或SC合用可获得更高的检出率。,沙门菌的分离培养基,HE琼脂：在保证细菌所需营养的基础上，加入了一些抑制剂，如：胆盐、柠檬酸盐、去氧胆酸钠等，可抑制某些肠道致病菌和革兰氏阳性菌的生长，但对革兰氏阴性的肠道致病菌则无抑制作用。,沙门菌在HE琼脂上的菌落形态：蓝绿色或蓝色，多数菌
13、株产H2S，中心呈黑色或几乎全黑色。,沙门菌的分离培养基,XLD琼脂：培养基中含有去氧胆酸钠作指示剂，在该浓度下的去氧胆酸钠也同时作为大肠埃希氏菌的抑制剂 ，而不影响沙门菌属和志贺菌属的生长。 XLD培养基分离沙门菌和志贺菌的敏感性超过了传统的培养基，如：EMB、SS、BS。因这些培养基尚有抑制志贺菌属生长的潜在因素，故本培养基是分离鉴定沙门菌及志贺菌属的可靠培养基。在国外广泛使用。,分离培养中的注意要点,非典型的沙门氏菌菌落形态：不存在典型的或可疑的沙门氏菌菌落时，按如下步骤检验非典型的沙门氏菌菌落。 HE和XLD琼脂：非典型的沙门氏菌在HE和XLD琼脂上呈黄色菌落，带或不带黑色中心。HE和
14、XLD平板经242小时培养后，没有典型的沙门氏菌菌落，则挑取2个或更多个非典型的沙门氏菌菌落。,BS琼脂：某些非典型菌株产生绿色菌落，其周围培养基稍微或不呈暗色。如果BS平板培养242小时后，没有出现典型菌落，则不挑取任何菌落，让平板继续培养242小时。如果经482小时培养后，仍没有典型或可疑的菌落出现，则挑取2个或更多个非典型的菌落。,沙门菌显色培养基,沙门菌显色培养基主要用于快速筛选、分离沙门菌。其基本原理：利用沙门菌特异性酶与显色基团的特有反应，使色原游离出来，沙门菌在培养基上呈紫色或紫红色。而大肠杆菌等其他肠道杆菌呈蓝绿色。,色原-特定结合物,色原特定结合物,沙门菌辛酸脂酶,无色,显色
15、,游离,可疑菌落的生化鉴定,自选择性琼脂平板（至少2种选择性平板）上直接挑取2个以上可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂(TSI)。 TSI的主要成分：蛋白胨、乳糖、蔗糖、葡萄糖、硫酸亚铁铵、硫代硫酸钠、酚红、琼脂。 在TSI琼脂中有2个指示剂体系： -酚红:在碱性环境中呈红色；在酸性环境中呈黄色。 -硫酸亚铁铵：是硫化氢的指示剂，可与硫化氢反应生成硫化铁呈黑色。硫代硫酸钠可防止硫化氢氧化形成S-S基而影响反应。,沙门菌在TSI琼脂上的反应,赖氨酸脱羧酶试验,赖氨酸脱羧酶试验培养基：蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、溴麝香草酚蓝（紫）。 原理：细菌使氨基酸脱羧，产生胺类，使培养基变碱，颜色不改变。 沙门菌的反
16、应：阳性。 意义：柠檬酸杆菌、志贺菌 均为阴 性；埃希氏菌不定。,注：本试验的阳性反应为培养基不改变颜色,而培养基变黄色者为阴性反应。本试验一定要设空白对照。培养基需用液体石蜡封盖，阻止空气的氧化作用。,靛基质试验,靛基质试验的培养基：蛋白胨水。 原理：细菌分解蛋白胨中色氨酸，生成靛基质，与对二氨基苯甲醛作用，形成玫瑰吲哚而呈红色。 沙门菌的反应：可以阳性或阴性反应。,尿素酶试验,尿素培养基：蛋白胨、葡萄糖、酚红、氯化钠、磷酸二氢钾、尿素，pH7.2。 原理：含尿素酶细菌能分解尿素，产生大量的氨，使培养基呈碱性，指示剂变红。 沙门菌的反应：阴性。,氰化钾试验,氰化钾试验培养基：蛋白胨、磷酸盐缓
17、冲对、氯化钠、氰化钾。 原理：氰化钾是剧毒药物，可抑制某些细菌的呼吸酶系统，使这些酶失去活性，细菌的生长因此受到抑制。而某些细菌可对氰化钾产生抗性，能在氰化钾培养中生长。本试验常用于沙门菌与柠檬酸杆菌的鉴定。 沙门菌生长情况：阴性（不生长）。 注：本试验必需设置对照管（不加氰化钾），若对照管细菌生长良好，试验管细菌不生长，可判定为阴性。若对照管与试验管均无细菌生长，则应重复试验。试验失败的主要原因是封口不严，氰化钾逐渐分解，生成氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低细菌生长，呈假阳性反应。,沙门菌生化鉴定培养基- -半乳糖苷酶(ONPG)试验,-半乳糖苷(ONPG)培养基：蛋白胨、ONPG。 原理：
18、大肠杆菌含有-半乳糖苷酶，能分解ONPG，使培养基呈黄色。 沙门菌的反应：阴性。,注：本试验主要用于不产H2S的沙门菌与大肠杆菌的判定,沙门菌生化鉴定的主要试验项目,糖发酵试验：三糖铁琼脂(葡萄糖、乳糖、蔗糖)、甘露醇、山梨醇、卫茅醇、水杨苷、ONPG。 氨基酸和蛋白质代谢试验：靛基质、赖氨酸脱羧酶、尿素酶。 碳源和氮源利用试验：丙二酸盐。 其他生化试验：氰化钾。,沙门菌在API 20E的典型反应,应用一系列小的多孔的聚苯乙烯卡片进行测 试，卡片含有干燥的抗菌药物和生化基质。先 制备一定浓度的欲鉴定菌株的菌悬液，然后将 菌悬液接种到各种细菌的小卡上，将其放入具 有读数功能的孵箱内，每隔一定时间
19、，仪器 会自动检测培养基的反应情况，并换算成能被 计算机所接受的生物编码。最后由计算机判 定，打印出鉴定结果。,VITEK GNI,沙门菌的血清学鉴定,培养基：一般使用1.5%的琼脂斜面作纯培养，取培养物(抗原)作玻片凝集试验。 国内使用的沙门菌O抗原多价诊断血清：A-F多价诊断血清。,血清学鉴定时的注意要点： 做血清凝集时，同时应用生理盐水做对照。 O血清不凝集时，可将菌株转接于琼脂量较高(如2.53%)的斜面上，再做凝集。 如果由于Vi抗原的存在而阻止了O抗原的凝集反应时，应挑取菌苔于1mL生理盐水中做成菌悬液。煮沸后再检查。(常见于伤寒沙门菌)。 当二相沙门菌只检出一相H抗原时，可在琼脂
20、斜面上移种12代后再检查，如仍只检出一相H抗原，可用位相变异的方法诱导另一相。,沙门菌的仪器检测法,VIDAS（生物梅里埃公司） BAX （杜邦公司）,VIDAS 应用酶联免疫技术制造的全自动免疫分析仪 ，用荧光分析技术通过固相吸附器，用已知抗体来捕捉目标生物体，然后以带荧光的酶联抗体再次结合，经充分冲洗，通过激发光源检测，即能自动读出发光的阳性标本，其优点是检测灵敏度高，速度快，可以在48小时的时间内快速鉴定沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、单核李斯特菌，空肠弯曲杆菌和葡萄球菌肠毒素等。,DUPONT Qualicon BAX System 应用DNA分子核酸探针或基因探针技术制造的全自动PCR分析仪。将已知核苷酸序列DNA片段用同位素或其他方法标记，加入已变性的被检DNA样品中，在一定条件下即可与该样品中有同源序列的DNA区段形成杂交双链，从而达到鉴定样品中DNA的目的。,谢谢!,