生化2蛋白质化学.ppt

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1、,第二章 蛋白质(Protein)化学,蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。 蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。,学习目的与要求:,1.蛋白质化学的基本组成单位。 2.氨基酸的结构、性质及分离测定方法。 3.肽及其结构。 4.蛋白质的结构，性质，功能及分离纯化与测定 原理方法。 重点 1.氨基酸的结构及性质。 2.蛋白质的结构、性质、功能。 3.氨基酸及蛋白质的分离测定方法。 难点 1. 氨基酸的两性性质。 2. 蛋白质一级结构的测定 3. 蛋白质的二级结构的要点 4. 蛋白质结构与功能的关系。,1.蛋白质是生物体内的结构高分子,2.

2、蛋白质是一种生物体内的功能高分子,（1）酶的催化作用 （2）调节作用(多肽类激素) （3）运输功能 （4）运动功能 （5）免疫保护作用(干扰素) （6）接受、传递信息的受体 （7）毒蛋白,第一节 蛋白质分子组成成分,一.元素组成,这些元素在蛋白质中的组成百分比约为： 碳 5055 氮 1517% 铁,锌,锰,钼,碘,铜等 氢 68 硫 04 氧 2023 磷 01%,蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、碘、锌和铜等。,其中氮含量较恒定，平均16%。一克氮=6.25克蛋白质。这是凯氏定氮法的依据。,二 .蛋白质的水解,

3、证明：氨基酸是蛋白质的基本组成单位,三.基本组成单位氨基酸,（一）氨基酸的结构通式,1.特点,氨基酸的结构决定了有如下特点： 具有酸性的羧基和碱性的氨基 -碳为手性碳原子 由于R侧链不同,或,分子型,离子型,2.非蛋白氨基酸,（二）.氨基酸的分类,第二节 氨基酸性质,一、氨基酸的光学活性和光吸收性质,酪氨酸的max278nm，278=1.4x103; 苯丙氨酸的max259nm，259=2.0x102; 色氨酸的max279nm，279=5.6x103;,氨基酸的光吸收,二.氨基酸的两性离解性质,氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，

4、氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在。,“ +” 正离子 PHPI,“0” 两性离子 PH=PI,“-” 负离子 PHPI,1.两性离子,同一分子中既有带正电荷的离子又有带负电荷的离子， 这种离子称为两性离子。,2. 氨基酸的等电点,在一定的pH值时，氨基酸分子中氨基的离解度等于羧基的离解度时，所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷为0。在电场中既不向正极移动，也不向负极移动，这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。,在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。,3. 氨基酸的等电点的计算,等电点时：,等式两边取负对数,-

5、logK1+(-logK2)=2(-logH+),pK1+pK2=2pH,侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK1和pK2的算术平均值：pI = (pK1 + pK2 )/2,等电点等于酸性基团离解常数与碱性基团离解常数之和的一半,或等电点等于两性离子两侧离解基团离解常数之和的一半,Lys的解离如下：,Asp解离如下:,4.根据滴定曲线求pK,三.氨基酸的化学反应,1.与甲醛反应,（一）.氨基参与的反应,2.与亚硝酸反应,此反应是Vanslyke定氮的原理,3. 与2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应,4.与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应,5.与丹磺酰氯反应:,在碱性条件下，丹磺酰氯（

6、二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。,（二）.羧基参与的反应肼解反应,此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。,（三）.氨基和羧基共同参与的反应茚三酮反应,蓝紫色化合物,入max=570nm,脯氨酸，羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色物质,入max=440nm,（四）R-侧链反应-呈色反应,第三节.氨基酸的分离与测定,一.层析法 二.电泳法 三.氨基酸

7、的测定,第四节 肽,一.肽的结构,二.生物活性肽,+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- Met-脑啡肽 +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Leu-脑啡肽,1.谷胱甘肽,2.脑啡肽,4.短杆菌肽S（Orn鸟氨酸）,3.催产素,第五节 蛋白质分类,一.根据蛋白质分子形状分类,1.球状蛋白 2.纤维状蛋白,二.根据蛋白质的组成成份分类,1.单纯蛋白 2.结合蛋白 清蛋白 核蛋白 谷蛋白和醇溶谷蛋白 色蛋白 精蛋白和组蛋白 糖蛋白 硬蛋白 脂蛋白 磷蛋白,第六节 蛋白质的一级结构,一.蛋白质的氨基酸组成,1.蛋白质的氨基酸组成可用残基重量百分数表示,14

8、7 165,如：100克胰岛素 分析得到 phe8.6克，其重量百分数为：,残基分子量,2.根据百分组成计算氨基酸的分子个数,如：胰岛素分子量为6000，丙氨酸占4.6%，氨基酸个数为：,a盐键（离子键 ） b氢键 c疏水相互作用力 d 范德华力 e二硫键 f 酯键,二.蛋白质分子结构中的化学键,维系蛋白质分子的一级结构：肽键 维系蛋白质分子的二级结构：氢键 维系蛋白质分子的三级结构：疏水相 互作用力 维系蛋白质分子的四级结构：范德华力、盐键、氢键、疏水相互作用力,氢键、范德华力、疏水相互作用力、盐键，均为次级键 氢键、范德华力虽然键能小，但数量大 疏水相互作用力对维持三级结构特别重要 盐键数

9、量小 二硫键对稳定蛋白质构象很重要，二硫键越多，蛋白质分子构象越稳定,三.蛋白质一级结构的测定,（一）氨基酸组成成分分析 （二）末端分析 1.N-末端 2.C-末端 （三）肽链伸展与分离 （四）肽链部分水解与肽段分离 （五）肽段的氨基酸顺序测定 （六）由各段顺序推断的氨基酸顺序,化学法：,溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。,酶法,第七节 蛋白质的高级结构,高级结构的概念：,1. -螺旋,一. 二级结构,要点： 螺旋的角度与高度 维持螺旋的作用力 影响螺旋稳定的因素 螺旋的种类,2. -折叠,要点： 肽链的走向（种类） 残基轴心距离 维持的作用力 影响螺旋稳定的因素,3

10、.-转角,4.自由回折,氢键,1800的回转, ,二.超二级结构, ,三.三级结构,要点： 形状 折叠 作用力,四.四级结构,一级结构二级结构超二级结构结构域三级结构亚基四级结构,第八节 蛋白质分子结构与功能,一.一级结构与功能的关系,1.胰岛素的结构与功能,2.血红蛋白结构与功能,3.细胞色素C与生物进化,二.蛋白质的构象与功能的关系,三.个别蛋白质结构与功能,1.纤维状蛋白角蛋白,2.丝心蛋白,第九节 蛋白质的性质,一.蛋白质的分子大小,1.根据化学成分测定最小相对分子质量,据其百分含量可计算出最低相对分子质量：,2.沉降系数,一个S单位，为110-13秒 蛋白质的沉降系数：1200S，相

11、对分子质量越大，S值越大 由沉降系数S可根据斯维得贝格Svedberg方程计算蛋白质分子的相对分子质量： M=RST/D1i R：气体常数 T：绝对温度 D：扩散系数 ：溶剂的密度,蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时(Isoelectric point pI)，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。 在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳(Electrophoresis)。,由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。

12、蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。,二. 蛋白质的两性离解和电泳现象,三.蛋白质的胶体性质,四.蛋白质的沉淀作用,蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、 所带的电荷和水化作用有关。 改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质 在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。,蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性.,五.蛋白质的变性,大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨

13、酸。这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。,六.蛋白质的紫外吸收,蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象。利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。,第十节 蛋白质分离纯化及测定,一. 蛋白质分离纯化的方法,凝胶过滤法,凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构 一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外 洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大 测定蛋白质分子量一般用葡聚糖，商品名： Sephadex,二. 蛋白质浓度测定的方法,1.福林试剂反应,福林试剂：磷钼酸-磷钨酸将福林试剂还原，产生磷钼蓝和磷钨 蓝混合物。酪氨酸、色氨酸的反应（还原反应）,2.双缩脲法,在碱性条件下，蛋白质与硫酸铜发生反应 蛋白质-铜络合物，灵敏度提高100倍,3.考马斯亮蓝G-250,本身为红色，与蛋白质反应呈蓝色，与蛋白的亲和力强，灵敏度高， 1-1000微克/毫升,4.凯氏定氮法,5.紫外吸收法,