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1、,Bacillus thuringiensis 苏云金芽孢（胞）杆菌,内 容,发展历史 形态特征及生理生化 生物活性物质 分类及命名 分离,菌种选育 菌种保藏 生态学和地理分布 生产 应用,一、发展历史,一、发展历史,1901：日本石渡发现家蚕猝倒病 1911：Berliner命名 1938：法 Sporeine 第一个商品制剂 1953：Hannay 伴孢晶体 1959：-exotoxin 1970：HD-1 1977：Bti-医学 线虫、防病、抗癌 105年，农业医学,中国发展史,1941： 蒲蛰龙 菜青虫 解放初 ：孟雨 法国 1955：曹骥 法国商品分离、Lab杀虫 1959 ：张履鸿
2、(苏)刘崇乐(福州人)捷克-玉米螟 1961： 彭中允 (苏) 1965 武汉、长沙生产 1986- 攻关、火炬、技改、863、973 改革开放为生物工程发展提供了机遇！,1901 Lepidopteran,1977 Dipterans,1980s Colepterans,1990s Mites, protozoa,1998 tumor cell,Activity spectrum of B.t.,nematodes,二、 形态特征及生理生化,1、形态特征 周鞭(无鞭)、G+、H抗原、O抗原 芽孢: 石碳酸复红、孔雀绿 芽晶: 芽孢高抗逆，菌株保存方式 晶体典型为菱形、也有圆形、方形、椭圆形、
3、不规则形，1个（几个)毒素、无毒 France: Pasteur Institute Dr. de Barjac,Vegetative cell of Bacillus thuringiensis,Spore and parasporal crystal,spore,Crystal,Crystal diversity of B. thuringiensis,2、生理生化: 要求不高。 碳 源: 淀粉、糊精、麦芽糖、葡萄糖 N 源: 牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、花生饼粉、豆饼粉、鱼粉、玉米浆 无机盐: K2HPO4、MgSO4、CaCO3。主要元素有磷、硫、镁、钾、钠、钙，微量元素锰、锌、硅、铁，所
4、需甚微，水杂质即可满足，多了有毒。 温 度: 10-40，28-32适。 pH：微碱性条件 氧: 好氧 紫外线 抗生素及化学物: 放线菌素D、氯霉素、红霉素。 乳化剂抑制 发酵工程的前提,Midgut epithelial Cell perforation,Sepsis death,3、Mode of action,生物活性物质,苏云金芽胞杆 菌活性因子,胞内,胞外,苏云金素,双效菌素,营养期杀虫蛋白,活芽胞 死芽胞 芽胞衣,芽胞,杀虫晶体蛋白 免疫抑制因子A 肠毒素 辅助蛋白 自身诱导物抑制蛋白,蛋白质,蛋白质,核苷类,多元醇类,酶类,几丁质酶 卵磷酯酶C,溶血素,原生动物,原始后生动物,海
5、绵动物,扁形动物门,轮虫纲,腹毛纲,线虫动物门,软体动物门,环节动物门,节肢动物门,鳞翅目 双翅目 鞘翅目 膜翅目 螨类 等9个目,纽形动物门,棘皮动物门,苔藓动物门,腕足动物门,半索动物门,脊椎动物门,癌细胞,植物线虫 动物线虫 丝虫,活 性 谱,疟原虫,血吸虫,肺吸虫,cry4A, cry4B, cry11A, cyt1A,subsp. isrealensis,Dipterans,Meloidogyue sp.,novel toxin genes:,mites, nematodes, protozoa,cry5, cry6, cry7, cry8, cry1Ea,Used genes fo
6、r transgenic plants,cry1Aa cry1Ab cry1Ac,cry1C,cry3A,cry2A,cry1Ab /cry1C,cry9C,Transgenic cotton,Transgenic corn,Transgenic forest,四、 分类及命名,1、鉴定及分类 (1) 生理生化：碳源、氮源、酶、代谢物 (2) 酯酶电泳 (3) H抗原: 德语Hauch(扩散) 英、日、美、法4位专家建议 (1982)-H.de Barjac博士(法国) (4) PCR,分子生物学,1、基因鉴定（cry/chi/vip/aii/ihnA/cyt) 2、克隆、表达 3、构建工程菌
7、（细胞工程、基因工程） 4、转基因植物,工程菌研究 出发菌杀虫谱不广、毒力效价不高 细胞融合、基因重组,杀虫假单孢工程菌的构建 Bt菌: 在土壤中不稳定，难防治土壤害虫; 寿命短，需重复使用 荧光假单孢菌(P. fluorescens)：植物根围和土壤中常见的有益细菌，对环境适应性强、同植物亲和性好、对人畜安全，不少菌株还防病增产。 美国孟山都公司：HD-1 ICP基因整合到玉米根际菌上 荷兰植物保护研究所 美国的Mycogen公司：CellCap, 较长的持效期、防止紫外线对ICP的破坏。M-Trak和M-peril 中国农科院植保所：荧光假单孢菌P303，防治禾谷类全蚀病。 美国威斯康辛大
8、学：整合到植物根部和叶部的定居菌洋葱假单孢(P. cepacia),植物疫苗-Incide 禾本科杂草狗牙根中寄生细菌(Clavibacter xyli subsp.cynodontis),构建遗传工程杆状病毒杀虫剂 杆状病毒杀虫需时较长，限制了它的商品价值 插入对昆虫有效的毒素、激素等基因,垂直传播,以蓝细菌等构建Bt杀蚊工程菌 蚊子：疟疾、黄热病、登革热和丝虫病等疾病传播媒介，幼虫以微生物水藻和细菌为食 两大难题需予克服:一是有效性，二为安全性 蓝细菌(Cyanobacterium)：一种生活在水体表面，对营养要求不高，容易为蚊子幼虫摄食的光能细菌。一些种能适应淡水和盐水环境，对温度耐性亦
9、较宽。它们容易用染色体或质粒转化，外源基因的表达载体亦已构建。,以枯草杆菌和其它芽孢菌 构建的工程菌 杀虫防病多功能工程菌 未来： 杀虫、抗病、除草、增产、固氮,植物抗虫基因的显著优点 育种期限短，目的性强 连续性保护，任何时期作用，避免反复多次 喷洒农药，不受气候影响和环境干扰 仅对取食转基因作物的那些害虫才有效，对 非靶生物没有影响 抗虫物质只存在于植物体内，在土壤和地下 水中无残留，不存在环境问题。 能保护那些难以喷洒到的植物部位如根部 与发展新型杀虫剂相比，投资较少。,Bt基因的表达和修饰 原核生物基因表达调控系统具有原核生物特性， 真核生物不能识别和运用这套表达调控系统 Bt毒蛋白基
10、因在转基因植物中的表达与其长度有关 mRNA不稳定和翻译效率低 基因修饰 置换核苷酸残基 广泛修饰：66.6密码子第三位的A或T碱基被G或C取代,密码子偏爱(codon preference) 大部分-内毒素偏爱的氨基酸密码子往往是植物最不喜爱的密码子，尤其是在GC含量极高的单子叶植物如玉米。因此，Bt-内毒素基因中密码子用法的改造会导致单子叶植物和双子叶植物上异源基因表达的增强。,问题 工程植物的安全性 基因的表达量 基因的定位表达 昆虫的抗性,2、命名 采集地: 苏云金、肯尼亚、以色列、九州、 东北、云南、武汉、华中、山东等。 (2) 寄主虫名：蜡螟、玉米螟、松毛虫等。 (3) 分离者：K
11、urstak、Thompson、Morrison等。 (4) 病症：猝倒、亚毒、杀虫等。,五、分离,昆虫 土壤：大本营，土壤习居菌。 Martin和Travers：2年（72个），24菌种，85年。 叶片 苔藓 60000：菌株非凡重视程度 昆虫体(22%) 土壤(44%) 贮藏物（18%） 其他（16%）,六、菌种选育,高毒力 良好的发酵和生产性能 对原材料的要求 生产稳定性 退化 现有菌株 育种技术,七、菌种保藏,2004.2.15. 100多位世界微生物专家齐聚北京，在“21世纪微生物资源中心的使命”的国际学术研讨会上达成共识：建立全球共享的微生物资源中心是大势所趋。 微生物菌种保藏专门
12、机构：59个国家 菌种保藏中心：495个，90万余株。美国的ATCC （综合最大， 12万株）。美国农业部的NRRL（最大农业微生物菌种中心，8万株）。中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC) 仅3000多株。,1、原理和要求 总原则：代谢速度低，又不失活。 低温：液氮、冷冻 隔氧：石蜡油 干燥：砂土管,2. 方法 (1) 砂土管：简单，不易污染 (2) 冷冻干燥：美国农业部 Brownsville Lab (3) 滤纸条：法国Pasteur研究所 (4) 液体石蜡斜面法：日本九州大学 (5) 菌膜保藏法： 便于邮寄，使菌种 保藏微型化,3、机构 美国：Ecogen公司：9000株 农业部B
13、rownsville Lab，HD-X系列 Ohio州立大学，大量突变株。 法国：巴斯德研究所（WHO昆虫病原细菌参考 中心）3500株 英国：温室作物研究所H.Burges博士HB-X系列 日本：九州大学Aizawa和Ohha博士、北海道大学 IIZUKA教授 国内：华中农大、中国林业科学院、湖北农科院、 中科院武汉病毒所、南开大学、福建农大,八、生态学和地理分布,1、地理区域 日本：发源地，广泛分布 美国：主要分布东部和东南部，类似于中国， 该地区是农业比较发达的地区。 中国：十分丰富。集中东北、华中、华东、 华南，西部和西北分离数较少。 生物多样性：澳大利亚、新西兰、丹麦、越南,2、地理
14、环境 (1) 饲养昆虫 (2) 贮藏产品 (3）土壤 (4) 植物体表面,九、 生产,1、概况 1938：法国 60年代后: 多国 中国: 1976，年产量超过30000吨 液体深层发酵、半固体发酵 噬菌体 后处理工艺,培养基优化/后处理,正交设计 二次回归旋转设计 均匀设计 板框压滤 连续离心 超滤,2、产品标准化 芽孢 生物测定：初孵家蚕、菜青虫、棉铃虫、小菜蛾 蛋白晶体 3、安全性问题 9种鱼、鸡、鼠、猪、兔、猴、牛、鸟、鸭、鹅 人体：口服、饲喂、吸入、注射 -外毒素：哺乳动物有害 Bt近缘Bc（产生食物毒素、引起腹泻、呕吐、恶心） Ba（人、畜炭疽病和头部生病、肺损伤和肠道感染） Bt
15、i 溶液的伴孢晶体毒素对动物有毒 肠毒素,5、剂型 (1) 液剂: 普遍、方便 水剂、乳剂、油剂 (2) 可湿性粉剂: 主产品，保存、包装、运输方便 胶囊剂: 防止阳光、高温、干燥对芽孢和晶体 的破坏，又使毒性成分逐渐释放，保 护剂可防止紫外辐射的伤害,我国Bt现状,80家，139个产品，产量4万吨 应用5000-6000万亩次，复配48家，登记产品74个，106个厂、213个产品 山东：24 河南：7 湖北：7 福建：6 山西：6 有机食品论证：Bt已通过，阿维菌素不行,质量标准化,1995：农业部标准：生测 1999：化工部：毒蛋白 2004.9：公布了原粉、WP、 悬浮剂三个国家标准,问题,厂家多、规模小、质量难保证：2000-3000万 产值只有3-4家。 菌种剂型单一：只登记Btk 、Bti； 生产水平相对落后，后处理简单：碟片式分离损失30%以上。 质检 提纯：向抗生素学习，现在8%，上20%就好。,十、应用,(1) 蔬菜 (2) 棉花 (3) 水稻 (4) 玉米、高梁、小麦 (5) 果树、茶叶、花卉 (6) 烟草和油料害虫 (7) 森林害虫 (8) 仓贮害虫 (9) 卫生昆虫,未来的路在延伸,资源：新基因 集合各种优势，构建多功能工程菌 转基因植物的扩大 发酵水平的提高 各种酶的研究和利用 代谢途径的了解 功能基因组学、蛋白质组学,