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1、第五章 医药生物技术,5-1 人类基因体计划 5-2 基因治疗 5-3 免疫作用 5-4 干细胞 5-5 组织工程 5-6 制药与生物技术 5-7 药物基因体学 5-8 中草药,人 类 基 因 体 计 划 Human Genome Project (HGP),约翰 萨尔斯顿 John E. Sulston,(影片: HGP.mpg),100兆细胞、30亿硷基对 97% 功能不明(?) 1.1%表现序列(exons)外显子 24% 内含子(introns) 75%基因序列没有实际作用或功能未知 人与人差异0.5%） 与黑猩猩相同性 98.8% 基因总数 2.0-2.5万,重要发现,人类基因数一,
2、人类基因数二,人类基因数三,人类基因图谱的绘制,遗传图谱(genetic map)：基因连锁图谱 发生基因重组概率大小 基因相对位置图谱 单位centimorgan (cM) 基因距离愈远重组概率愈高，近概率低 物理图谱(physical map) DNA上限制酶的位置 染色体限制片段的顺序 单位Mb (mega base pair) Kb cDNA 基因在染色体上的位置,人类染色体图谱一,参考资料：http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/guide/human/,人类染色体图谱二,参考资料：http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/p
3、rojects/genome/guide/human/,5-2 基因治疗,1990 NIH 腺苷脱氨酶 (ADA, adenosine deaminase )基因(deoxyinosine与deoxyadenosine没有办法代谢成inosine与adenosine，而积累的adenosine将会造成T细胞失去功能，进而丧失身体细胞免疫的作用) +反转录病毒 T 淋巴球 送回体内 体外In vitro 活体In vivo 体内生合成denovo,将一外来DNA送入细胞内，藉以治疗基因缺陷或突变所引起的疾病,病毒载体-危险性、效率高 反转录病毒: RNA DNA 插入宿主染色体(随机)，产生变异
4、或造成不具功能 腺病毒: 同源基因重组、问题-产生发炎反应 腺病毒关联载体：限制-转殖基因有限 疱皮疹毒：缺点-病毒本身太复杂 非病毒载体-安全性高、效率差 物理方式: 基因枪导入法、电穿孔法、直接将DNA打入肌肉(DNA疫苗) 化学方式:微脂粒导入法(表现皆短暂性)、 磷酸钙沉淀法(利用细胞的胞饮作用),基因治疗常用的方法,基因治疗标的细胞的种类,体细胞基因治疗法 仅修正体细胞 对生殖细胞没有影响 生殖细胞基因疗法 除了修正体细胞 影响生殖细胞可遗传,基因治疗的应用范围,癌症治疗 使用免疫调控基因：细胞激素基因送入癌细胞癌症疫苗疫苗打入动物体诱发宿主的免疫系统辨识癌细胞 送入自杀基因-配合药
5、物作用 引入抑癌或细胞凋亡基因使用抗血管生成因子：利用反义(anti-sense)RNA (p53gene.mpg) 感染性疾病治疗 送入感染处抑制病原菌基因表现 遗传疾病治疗 技术限制-单一基因疾病 心脏血管疾病治疗 利用某些自杀基因消除增生的血管细胞,(影片: tga.mpg),基因治疗所遭遇的困难,基因嵌入细胞的效率不佳，反转录病毒外，其它不尽理想 基因能否表现? 基因重组导致癌症的发生,癌症形成的原因相当的复杂 细胞核基因的异常是导致癌症发生的基本原因 在人体细胞中，所有谓的致癌基因(oncogen)和抑癌基因(tumor suppressor gene)。致癌基因或是抑癌基因的缺损或
6、是变异容易导致癌症的发生 (影片: cancer.mpg) 癌症发生的相关危险因子 遗传 家族性大肠息肉症(Familial polyposis syndrome) （大肠癌） 母亲或是姊妹有乳癌患者，则罹患乳癌的比率也会大为提高 放射线 核爆生还者罹患血癌的比例大为提高 放射线碘容易引起甲状腺癌,癌症的形成原因,B型、C型肝炎病毒带原者较常人易引起肝癌 Epstein-Barr病毒易引起Burkitt氏淋巴瘤(Burkitts lymphoma) 人类乳突病毒(Human papilloma virus)易引起子宫颈癌 HTLV-1人类T 细胞白血球第一型病毒感染者有一小部份会发生T细胞淋巴
7、瘤 (细菌感染)胃中特殊的幽门杆菌(Helicobacter pylori)和淋巴瘤 (MALToma) 化学或药物刺激 黄麴毒素易引起肝癌 石绵易引起肺癌和间皮瘤(mesothelioma) 芳香族化合物和膀胱癌的关系也曾被报告过,病毒感染,长期动情激素(estrogen)的刺激是子宫内膜癌和乳癌的危险因子之一 所以初经早、停经晚、和未生育小孩的妇女，其动情激素的刺激较久，发生子宫内膜癌和乳癌的机会较高 饮食因素 多食用青菜水果纤维素等已被证实有效降低癌症的发生率 饮食中过多脂肪容易肥胖，而肥胖容易导致脂溶性致癌毒性物质囤积在身体中有较高的致癌机会 过多的腌制食物，其致癌物质，如亚硝胺类等，
8、也会增加，因而提高致癌的机会,激素刺激,不良的行为，如抽烟、喝酒等，会增加肺癌和食道癌的发生机会 多重性伴侣及危险性性行为等，会增加感染人类乳突病毒的机会，因而增加子宫颈癌的发生率,行为因素,96年国内十大死因,恶性肿瘤占28.9% 心脏疾病占9.3% 脑血管疾病占9.2% 糖尿病占7.3% 事故伤害占5.1% 肺炎占4.2% 慢性肝病及肝硬化占3.7% 肾炎、肾徵候群及肾性病变占3.7% 自杀占2.8% 上血压性疾病占1.4%,男性前十大恶性肿瘤种类 肝癌、肺癌、结肠直肠癌、口腔癌、胃癌、食道癌、摄护腺癌、胰脏癌、非何杰金淋巴癌、鼻咽癌 女性前十大恶性肿瘤种类 肺癌、肝癌、结肠直肠癌、女性乳
9、癌、胃癌、子宫颈癌、胰脏癌、非何杰金淋巴癌、胆囊癌、卵巢癌,基础免疫观念一,细胞免疫与体液免疫 细胞免疫: 胸腺细胞主导 杀手细胞: 直接辨识病原 辅助者细胞: 帮助B细胞产生抗体 体液免疫: B细胞主导(产生抗体的细胞) 抗体可辨识抗原 主动免疫与被动免疫 主动免疫: 接触抗原后自行产生免疫反应，产生记忆反应 被动免疫: 注射抗体所诱发,非专一性免疫反应（先天免疫） 反应介质 补体 发炎介质 杀菌物质 反应细胞 颗粒球（嗜中、酸、硷性球） 巨噬细胞 自然杀手细胞 肥大细胞,专一性免疫反应（后天免疫） 反应介质 免疫球蛋白（抗体） 细胞激素 细胞毒杀因子 反应细胞 抗原呈现细胞 辅助型T细胞
10、毒杀型T细胞 B淋巴球,基础免疫观念二,免疫细胞起源：淋巴系统与造血系统一,免疫细胞起源：淋巴系统与造血系统二,（影片: immuno.mpg）,（曾哲明, 2006),(影片: immuno1.mpg),严重急性呼吸道症候群(SARS),Severe Acute Respiratory Syndrome 冠状病毒 CORONAVIRUSES 最适生长温度 33-35 次易引发普通感冒的病毒 仅有两株分离的人类病毒株 核酸：正股RNA、套膜、 80-160 nm 演化分析归类为第四类冠状病毒 基因体 +RNA - 27,000-31,000 nt 重症患者肺部严重纤维化、呼吸衰竭,反转录聚合酶
11、连锁反应（RT-PCR） 将RNA反转录成DNA，再继续将DNA数量放大 分离病毒RT-PCR 定序比对 即时PCR检测技术(Real-Time PCR) 传统PCR需要时间较久、解析度差、低正确性、低敏感度、无自动化、结果无法量化 利用萤光讯号，即时监测反应 免疫萤光抗体法(indirect fluorescent antibody test, IFA) 测病人血清中有无病毒抗体,冠状病毒检验方法,需要时间较久 琼胶解析度差（需差10倍） 低正确性 低敏感度 无自动化 只鉴别大小 结果无法量化 仅呈现PCR最后的结果 Real-Time PCR可改善上述的缺点,传统 PCR,Real-tim
12、e PCR,微生物或其表面抗原制作成对抗此病原的物质 具专一性 可使免疫系统产生反应与记忆 为主动免疫 人类免疫缺乏病毒（HIV）会引以爱滋病 到目前无法制造出有效的疫苗 WHY? 突变速率太快 多种躲避人体免疫系统侦测的策略,疫苗,(影片: hiv.mpg),单株抗体,抗体通常只与抗原上的一小段胺基酸结合 此小段胺基酸称为抗原决定位(antigenic determinant) 大分子量抗原-多抗原决定位(多价抗原) 单一抗体 VS 抗原之抗原决定位-提高免疫效率 一种B细胞一种抗体， 挑出所要之B细胞 大量培养均质抗体称为单株抗体(monoclonal antibody),细胞融合技术,将
13、不同的生物细胞染色体+细胞质融合 杂交细胞 (融合瘤细胞hybridoma) 单株抗体+药物 癌细胞为抗原,单株抗体的制作流程,参考资料：http:/www.thyroid- 全能干细胞：每个细胞均可发育成一完整生物体 多能干细胞：可发育成特定组织如：血液干细胞、神经干细胞、皮肤干细胞 来源: 人类胚胎囊胚期的内细胞质团，称人类胚胎干细胞 胎儿的生殖组织培养(经捐赠者同意),(影片: stemcell.mpg),(影片: differ.mpg),干细胞的应用一,干细胞的应用二,2006瑞士科学家利用羊水中的干细胞培育出心脏瓣膜 2007荷兰科学家进行细胞造肉工程 肌胚细胞加入养分网片生长肌肉纤
14、维 无化学添加物、生长激素、抗生素 脐带血 可发育成血液及免疫系统细胞 可恢复造血系统 (取代骨髓移植),胚胎 = 人 脐带血干细胞分化能力差 卫生署胚胎干细胞研究伦理规范 胚胎干细胞的来源限制 自然流产的胚胎组织 符合优生保健规定之人工流产的胚胎组织 人工生殖后得销毁之胚胎(未满14天) 不得提供精卵（通过人工授精制造胚胎供研究用） 细胞核转殖术制造之胚胎再审议 无偿提供 ，不得以复制人为研究目的 人体试验研究-治疗疾病与改善病情,胚胎干细胞 VS 伦理问题,复制的相关进展,复制技术 体细胞的细胞核经由体细胞核转殖到卵母细胞而产生的囊胚 可发育出活的个体 可培养成胚胎干细胞 暗示了卵母细胞的
15、细胞质可能含有一些因子可以将转殖后的体细胞核重新引导，导致到具有多能性的状态 2006年日本京都大学山中伸（Shinya Yamanaka) 教授将四种基因Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4转殖到老鼠已经分化的纤维母细胞 已分化的纤维组织母细胞重新设置变回干细胞,组织工程,将特殊细胞培植在骨架上，重建特定的组织或器官。最早产品人工皮肤 主要市场：整形外科、伤口疗护、心血管疾病 优点: 用少量组织体外增殖 量身订做器官原貌 易克服排斥问题 现况与未来 软骨、血管、皮肤、神经组织人造手 结合基因工程和干细胞技术,(影片: tissue.mpg),组织工程的要素,细胞 自体细胞、同种细胞、异种细胞、干细胞、基因改造细胞 人工细胞外间质 可分解天然或合成高分子材料 多孔性结构 胶原蛋白、藻胶酸、几丁质 合成聚合物-聚乳酸 生长信息 需有传达细胞贴附、增生、迁徙、分化的各种信息因子,(影片: material.mpg),已上市之重要组织工程产品一,已上市之重要组织工程产品二,人造皮肤一,人造皮肤二,参考资料：http:/ Plainsboro, NJ,