血清药理幻灯.ppt

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1、1,中药血清药理学,在肿瘤药理中的应用,及其,2,1概说 2血清供体动物的选择 3动物给药及采血方案的设计 4血清的灭活 5血清的添加,6含药血清的保存 7实验研究举例 8血清药理学研究中存在的问题 9血清药理学工作的发展趋势,3,1概说,中药血清药理实验方法是一种新的改良的中药体外实验方法。它将受试物（试验样品）经口给与动物后，取其血清作为药物源加入离体实验体系中研究其药理作用。,4,关于血清药理学的几篇重要的文献：,Iwama H，Effcet of Shosaikoto（复方小柴胡汤），a Japanese and Chinese Triditional herbal medicinal

2、 mixture on the mitogenic activity of lipopolysaccharide，A new pharmacology testing method， J Ethnopharmacol，1987，211：45， 田代真一，“血清药理学”“血清药化学”汉方药理学始药物血中浓度测定新世界，TDM研究，1988，（5）：54 张群豪、陈可冀：血清药理学在中药及复方研究中应用的评价，中国中西医结合杂志，1996，16（3）：131 张群豪、钟蓓、陈可冀，等：用血清药理学方法观察血府逐瘀浓缩丸对实验性动脉粥样硬化家兔主动脉平滑肌细胞增殖的影响，中国中西医结合杂志，1996

3、，16（3）：156,5,中药血清药理学实验操作基本过程：,分离血清 （灭活？）,保存 （条件？时间？）,6,2血清供体动物的选择,2.1动物的种属 实验证实动物血清具有细胞毒作用，体外细胞实验显示，这种细胞毒性作用似与种属亲缘有关，与实验体系中细胞亲缘关系最接近的动物血清细胞毒性作用最轻，而亲缘关系较远的动物血清，较高浓度时就会影响细胞的生存。,7,附表1 异种血清的细胞毒作用,与10%小牛血清组比较，a p0.05， b p0.01。 细胞毒性大小排队（由小到大）：大鼠家兔豚鼠犬小牛人。,8,上述实验动物在生物分类中的位置：,哺乳纲（Mamalia） 真兽亚纲（Eutheria） 啮齿目（

4、Rodentia）： 鼠科（Muridae） 小鼠：小鼠属（Mus）小家鼠（M.musculus）变种（M.n.albula） 大鼠：大鼠属（Rattus）褐家鼠（R.norregicus）变种（R.n.albus） 豚鼠科（Caviidae） 豚鼠：豚鼠属（Cavia）豚鼠（C. porcellus） 兔形目（Lagomorpha）（最初分类归于啮齿目） 兔科（Lepus） 家兔：真兔属（Oryctolagus）兔（O. cuniculus）,9,上述实验动物在生物分类中的位置：,食肉目（Carnivora） 犬科（Canidae） 犬：犬属（Canis）家犬（C. familiaris）

5、偶蹄目（Artiodactyla） 牛科（Bovidae） 牛：牛属（Bos）黄牛（Bos Taurus domesticus Gmelin） 水牛属（Bubalus）水牛（Bubalus bubalis Linnaeus） 灵长目（Primates） 人科（Hominidae） 人：人属（Homo）智人（H. sapiens） 中药肿瘤血清药理学研究中所用动物主要为小鼠、大鼠以及家兔,10,2血清供体动物的选择,2.2动物的状态 依据实验的具体情况供体动物可以选择生理状态下的动物，也可以选择病理状态（疾病模型）下的动物。 中药肿瘤血清药理学研究中所用血清供体动物，主要选择正常生理状态下的动物

6、，但亦有选择荷瘤动物作为供体动物的。,11,3动物给药及采血方案的设计,3.1给药剂量与次数 A已知临床用药剂量 给药剂量=临床人用剂量动物等效剂量系数在体外实验体系内的稀释度。 B已知动物药效学实验的有效剂量 给药剂量=动物药效学实验有效剂量动物等效剂量换算系数（更换动物时）在体外实验体系内的稀释度。,12,3动物给药及采血方案的设计,例如某中药临床人用剂量为10g/日，体重按50kg计算，则临床人用为0.2g/kg；血清供体动物选择大鼠，其等效剂量系数粗略的按照5来计算，在体外实验体系中添加含药血清的量按照20%进行（稀释倍数为5），代入上式计算得到： 供体动物给药剂量=0.255=5g/

7、kg,13,3动物给药及采血方案的设计,3.2给药次数 在大多数情况下，多次给药优于单次给药。 多次给药优于单次给药具有一定的理论依据，它的理论取决于以下两个因素： 其一、是药物有无蓄积作用，文献资料表明，大多数药物具有一定的蓄积性的； 其二、是多次给药后，是否会在药物的作用下机体产生自体活性物质，比如激素或免疫活性物质，以及这些活性物质在该药效学实验中作用的大小。,14,3动物给药及采血方案的设计,给药次数大多为每日1次，连续3至7天，但也可以参照血清药理学实验通法，每日给药2次（间隔12小时），连续给药3天。 另外，需要注意的是为了便于药物吸收，有人主张采血前的最后一次给药动物应予以禁食，

8、禁食时间一般认为以12 16小时为宜。,15,3动物给药及采血方案的设计,3.3采血时间与方法 3.3.1采血时间的确定 在实际操作中，采血时间大多在给药后1至2小时，也有缩短至0.5小时或延长至4小时的。 3.3.2采血要求：采血必须在严格无菌的条件下进行。如果采用麻醉的话，建议采用乙醚吸入麻醉。静置2小时以上，保证血液彻底凝固，得到真正的“血清”。离心（3000rpm）10至15分钟，得到含药血清。必要时，可以用0.22m微孔滤膜过滤除菌。,16,3动物给药及采血方案的设计,3.4关于中药血清药理学实验通法 资料：文献载有口服给药Tmax（血药高峰时间）的药物113个，文献载有T1/2（半

9、衰期）的药物412个。 基础理论依据：（1）药物多次给药后，经过45个T1/2达到坪值，此后停止给药，按一级动力学清除的药物也要经过45个T1/2在体内基本消除，对少数按照零级动力学（按每单位时间消除恒定药量使血浆浓度逐渐下降）消除的药物则需要更长时间。（2）在一次给药后，药物尚未达到完全消除而接受第二次给药，血药浓度可因蓄积而积累。,17,3动物给药及采血方案的设计,采血时间点确定：将已知口服给药Tmax数据的113个药物进行频谱分析如下： 附表3-1 Tmax的分布范围是15min 24h，符合正态分布，排列数据时0.5 1h按0.5h计算，1 2h按1h计算。 Tmax在1h的有49个药

10、物，占43.4%（49/113），若加上30min 1h的10个药，则比例高达52.2%（59/113），也就是说，口服药物后1h血中药物达到高峰浓度（Cmax）的机会（概率）是52.2%。,18,药物蓄积性分析：依据药动学理论，一种药物能否蓄积，取决于该药T1/2的长短和服药时间间隔。如果药物尚未完全消除而第二次给药，即可产生蓄积。412个已知T1/2的药品频谱分析如下：,附表3-2,T1/2分布范围是12min 150h，符合正态分布，T1/23h的药物有216个，占67%（216/412）。若每日给药2次，间隔12h，那么T1/23h的药物均可产生蓄积。,19,3动物给药及采血方案的设计

11、,依据上述推论得到实验通法。通法规定，口服给药，每日2次，间隔12h，连续给药3天，末次给药后1h采血，总体而言中药成分中约67%可能具有蓄积作用，再加上无蓄积性但在其口服后1h在Tmax内的68个药品，占412个药品中的16.5%，两者相加可达83.5%。,20,附表3-3 例：一项关于含药血清药理作用强度与体内给药的量效、时效关系研究的结果,注：与空白血清组比较，a p0.05， b p0.001。 n（每组复空数）=8，含药血清加入量10%。 实验方法：大鼠灌胃给以待测样品，剂量为45、90、180、360mg/kg，1/d，5d，末次给药后30、60、90、120分钟采血，制备含药血清

12、，作用于缺氧复氧损伤的乳鼠心肌细胞，通过测定LDH释放量及其抑制率来评价药物血清对心肌损伤的保护作用。,21,4血清的灭活,4.1血清灭活的原因与目的 附表4-1 灭活与非灭活正常（空白）血清对细胞生长的影响 与非灭活血清比较a p0.05， b p0.01 血清来源：大鼠； 细胞系：小鼠3T3细胞株。,22,4血清的灭活,附表4-2 灭活与否对含药血清生物活性的影响（一） 某药物含药血清对病毒致细胞病变作用的影响 血清来源：家兔 细胞系：Hep-2人喉癌细胞株 病毒：副流感病毒-型,23,附表4-3,灭活与否对含药血清生物活性的影响（二） 某药物含药血清对小鼠离体子宫收缩的影响,空白血清各组

13、均与未处理组比较 a p0.05， b p0.01采用同一处理方法空白血清组与含药血清组比较 p0.01。 血清来源： 小鼠,24,4血清的灭活,4.2血清灭活的方法 加热灭活法：加热56，维持30分钟。（最常用的方法） 丙酮灭活法：在血清中加入4至5倍量的丙酮，混匀，3000rpm离心，取上清液水浴，挥干丙酮即可。 乙醇灭活法：处置方法同丙酮灭活法。将丙酮更换成乙醇即可。,25,5血清的添加,决定药物血清添加量多少主要取决于以下两点： 血清本身具有生物活性，其中包括细胞毒活性。 中药成分的复杂性决定了药血清药理学量效关系往往不明确。,26,附表5 不同血清添加量对细胞（3T3）生长的影响,另

14、外，含药血清也可以制备成冻干粉直接加入实验体系中。 对于抗肿瘤中药血清药理学实验而言，含药血清的添加量一般多为10% 20%。,27,6含药血清的保存,在4环境下，一般不宜超过5天，低温条件下，可以适当延长保存时间。,28,7实验研究举例,29,例1,【样 品】中药肠安泰（组方：大黄 藤梨根 薏苡仁 木香等8味） 【研究目的】观察肠安泰及其主要成分药物（大黄、藤梨根）的含药血清对肿瘤细胞的杀伤能力。 【肿瘤细胞】Co26lu大肠癌细胞株 【动 物】Wistar大鼠，30010g。,30,例1,【给药方案】肠安泰（干膏）、大黄（干膏）、藤梨根（干膏），ig，0.6mlkg-1d-1。剂量分别为肠

15、安泰0.8gkg-1（相当于人用剂量的8倍），大黄0.8gkg-1，藤梨根0.8gkg-1。两种方案， 一日给药和三日给药，前者给药一次，1小时后采血，后者连续给药三日，每日一次，末次给药后1小时采血。给药前均禁食6 12小时。,31,例1,【血清处置】56，30分钟灭活，-20保存备用。 【试验体系】肿瘤细胞1106个/ml，加入96孔板，90l/孔。 【血清加量】10%、30%、50%。 【评价方法】MTT法,32,例1,【评价指标】OD值、肿瘤生长抑制率。 【实验过程】动物给药， 采血， 分离血清， 加入试验体系， 37，5%CO2培养24小时， 加入MTT，4小时， 比色， 测定OD值

16、， 计算肿瘤生长抑制率。 【实验结果】详见附表,33,例1实验结果附表,与模型组相比，P0.05，P0.01。,34,例1,【实验结论】肠安泰具有抑制肿瘤细胞增殖的活性，并呈剂量依赖性，且复方的抗肿瘤活性优于单味药。 王文萍，等：中药肠安泰体外对Co26lu大肠癌细胞的血清药理学研究，中华中医药研究，2006，21（4）：213,35,例2,【样 品】参葵汤（苦参 龙葵 山慈菇 墓头回 莪术 黄芪 女贞子 当归 甘草等12味） 【研究目的】研究参葵汤对卵巢癌细胞增殖的影响 【肿瘤细胞】Tyk-nu卵巢癌细胞株，人新鲜的卵巢癌组织分离细胞。 【动 物】SD大鼠，30010g。,36,例2,【给药

17、方案】灌胃给药，3.27、6.54、13.08g / 300g（等于10.9、21.8、43.6g / kg，相当于临床人用的等效剂量、2及4倍等效剂量），每日1次， 连续10日， 末次给药后1小时采血 【血清处置】56，30分钟灭活。,37,例2,【实验体系】肿瘤细胞5105个/ml，加入96孔板，190l/孔，3复孔。 【血清加量】20%，配置培养基时加入。 【评价方法】3H-TdR掺入法、流式细胞术、胎盘兰染色计数、细胞集落形成。 【评价指标】同位素放射脉冲量（cpm）、细胞增殖指数（PI）、细胞活力、集落形成率、,38,例2,【实验过程】动物给药， 采血， 分离血清， 加入培养基中，分

18、离肿瘤组织，制备新鲜及传代培养的肿瘤细胞的悬液，37，5%CO2，100%湿度，分别培养60、72、48、72小时供cpm、PI、细胞活力、集落形成率等测定。 【实验结果】详见附表,39,例2实验结果附表,（一）含药血清对新鲜卵巢癌肿瘤组织细胞增殖的影响,与空白血清组比较P0.01； 与低浓度含药血清组比较P0.01； 与中浓度含药血清组比较P0.05。,40,（二）药血清对Tyk-nu卵巢癌细胞增殖的影响,与空白血清组比较P0.05； 与低浓度含药血清组比较 P0.01； 与中浓度含药血清组比较 P0.05 P0.05,41,例2,【实验结论】含参葵汤大鼠血清可抑制卵巢癌新鲜实体瘤细胞及卵巢

19、癌细胞株Tyk-nu细胞增殖。 张军，等：参葵汤对卵巢癌患者新鲜实体瘤细胞及细胞株Tyk-nu细胞增殖的影响，中医杂志， 2005，46（3）：219,42,例3,【样 品】三物白散加味方（含10%油的巴豆霜 贝母 桔梗 地鳖虫 莪术 参三七 生薏苡仁 全蝎 木香 炒白芍药 甘草等）（注：三物白散方 自伤寒论 【研究目的】在临床治疗胃癌有效的基础上， 观察药物对胃癌细胞肿瘤相关基因表达的影响 【肿瘤细胞】胃癌SGC-7901细胞株。 【动 物】日本大耳白，2.50.2kg，/，每剂量组2只。,43,例3,【给药方案】灌胃给药，0.21、0.63、2.1g/只，1次/日，连续3日，末次给药后2小

20、时， 心脏采血， 分离血清。 【血清处置】56，30分钟灭活，0.22m微孔过滤除菌， -20保存。 【实验体系】肿瘤细胞数量无记载。 【血清加量】100%。 （？） 【评价方法】单抗试剂盒， 流式细胞术 【评价指标】多药耐药基因MDR,44,例3,【实验过程】胃癌SGC-7901细胞株传代培养， 胰酶消化，分瓶，待细胞贴壁后加入三个剂量组的血清，作用10小时， 免疫标记，流式细胞仪测试。 【实验结果】三物白散加味方含药血清对胃癌肿瘤细胞多药耐药基因表达具有抑制作用，并呈量效关系。,45,三物白散加味方对MDR基因表达率的影响,与阴性对照组相比P0.01。,例3实验结果附表,46,例3,【实验

21、结论】三物白散加味方对胃癌肿瘤细胞多药耐药基因表达有抑制作用。 徐力，等：三物白散加味方影响多药耐药基因表达实验研究，上海中医药杂志，2005，39（8）：59,47,例4,【样 品】黄连解毒汤（黄连 黄芩 黄柏 栀子组成） 【研究目的】评价黄连解毒汤的抗肿瘤活性。 【肿瘤细胞】结肠癌Swille、肺腺癌SPC-A-1、胃癌SGC-7901、乳腺癌MCF-7细胞株。 【动 物】荷瘤（H22肝癌）小鼠，昆明种，18 22g，每组11 12只。,48,例4,【给药方案】灌胃给药， 黄连解毒汤49.5、16.5、5.5g/kg（相当于临床人用剂量的9、3、1倍），1次/日，连续8日，末次给药后1小时

22、摘眼球取血，分离并合并动物血清。同期给以阳性对照药环磷酰胺，25mg/kg。 【血清处置】（不灭活），0.22m微孔过滤除菌， -20保存。 【实验体系】4种肿瘤细胞配置浓度均为1105个/ ml，接种于96孔板，每孔100l，每组10复孔。 【血清加量】20%。 【评价方法】MTT法。 【评价指标】细胞生长抑制率。,49,例4,【实验过程】动物接种肿瘤细胞，分组，给药，给药结束，采血，分离合并血清，结肠癌Swille等肿瘤细胞体系中加入含药血清，培养72小时，加入MTT，培养4小时，比色， 测定吸光度，计算细胞生长抑制率。 【实验结果】详见附表。黄连解毒汤对H22小鼠肝癌实体瘤有一定的体内抗

23、肿瘤活性，并具剂量依赖性；其含药血清体外对4种人的肿瘤细胞也有一定的抑制作用。 【实验结论】黄连解毒汤体内、体外均有抗肿瘤活性，结果具有一致性且呈明确的量效关系。 孙健，等：黄连解毒汤抗肿瘤作用的实验研究，中国中药杂志，2006，31（17）：1461,50,例4实验结果附表 黄连解毒汤20%含药血清体内、外肿瘤抑制作用,与对照组相比， 2）P0.01，3）P0.001。,51,例5,【样 品】黄连解毒汤（黄连 黄芩 黄柏 栀子组成） 【研究目的】对比黄连解毒汤及其含药血清的抗肿瘤作用，进行化学成分分析。 【肿瘤细胞】肺癌NCI-H446、肝癌Bel-7402细胞株。 【动 物】Wistar大

24、鼠，250 300g，8只/组。 【给药方案】灌胃给药， 黄连解毒汤21、10.5、5.25g/kg，2次/日，连续3日，末次给药（灌药前禁食16小时）后2小时，乙醚麻醉，腹主动脉采血，无菌分离血清，同组血清合并。 【血清处置】56，30分钟灭活，0.22m微孔滤膜过滤除菌， -20保存。,52,例5,【实验体系】两种细胞悬液浓度均为2.5104个/ml，接种于96孔板，每孔100l，每组6复孔。 【血清加量】20%。 【评价方法】MTT法。 【评价指标】细胞生长抑制率。 【实验过程】在观察黄连解毒汤含药血清对肿瘤细胞作用的同时， 同步观察黄连解毒汤样品对肿瘤细胞生长的影响。 采用 HPLC梯

25、度洗脱对比分析了黄连解毒汤及其含药血清化学成分的异同。,53,例5,【实验结果】黄连解毒汤及其含药血清对肿瘤细胞生长的影响详见附表。结果发现，它们对2株肿瘤细胞的生长均有抑制作用，HPLC检测结果显示， 黄连解毒汤含药血清与空白血清对比发现，口服黄连解毒汤的吸收入学的成分较多，经过黄连解毒汤样品与其含药血清进行对比分析，初步确定了10个来源于复方的原型成分，同时还有几个代谢产物，但原方剂中的主要成分并未在血清中检测到。,54,例5实验结果附表 黄连解毒汤的肿瘤生长抑制作用,与0剂量组比较，1）P0.05，2）P0.01，3）P0.001,55,20%黄连解毒汤含药血清的肿瘤生长抑制作用,与空白

26、血清组比较：1）P0.01，2）P0.001。,56,例5,【实验结论】黄连解毒汤及其含药血清对2种瘤株抑制程度变化的原因可能是黄连解毒汤中各主要成分吸收入血后含量变化造成的。对其进行深入研究，将有助于阐明黄连解毒汤抗肿瘤的有效成分及作用机制。 孙健，等：黄连解毒汤及其含药血清的化学成分及抗肿瘤作用对比研究，中国中药杂志，2006，31（18）：1526,57,例6,【样 品】复方斑蝥胶囊（国药准字Z19993409）。 【研究目的】考察该药含药血清对肝癌肿瘤细胞蛋白质组的影响，从分子水平探讨其抗肿瘤的作用机制。 【肿瘤细胞】肝癌SMMC-7721细胞株。 【动 物】新西兰大耳白兔，2.50.

27、2kg，/兼用。,58,例6,【给药方案】按下述公式计算动物给药剂量： 动物给药剂量=临床用量等效剂量系数培养体系血清稀释度 式中：等效剂量系数（按体表面积计算）=S兔/S人 lgS = 0.8762 + 0.698 lgW（动物 体表面积和体重之间的关系式） S = 体表面积（cm2） W = 体重（g） 计算得到家兔给药剂量为3倍临床等效剂量。以PBS将复方斑蝥胶囊配置成混悬液，连续灌胃3日，末次给药后3小时心脏采血，收集血清，同组血清合并。,59,例6,【血清处置】56，30分钟灭活，0.22m微孔过滤除菌， -20保存。 【实验体系】（略） 【血清加量】10%。 【评价方法】双向电泳，

28、图像分析，质谱鉴定。 【评价指标】含药血清作用后差异蛋白的表达情况及质谱鉴定。 【实验过程】含药血清作用于肿瘤细胞72小时，分离，清洗，收集细胞；细胞裂解，提取蛋白质；蛋白质双向电泳，染色，图像分析，选取具有2倍以上量变的蛋白质（差异蛋白质）；质谱分析及数据库检索，鉴定蛋白质点。,60,例6,【实验结果】结果详见附表。 【实验结论】发现4种与肿瘤的增殖、免疫、凋亡相关的差异表达蛋白质，为进一步研究药物作用机制提供了线索。血清药理学与蛋白质组学相结合能够有效的展示与药物作用相关蛋白质，可以作为研究复方药理的一个初步技术平台。 曹永艳，等：复方斑蝥胶囊血清诱导人肝癌SMMC-7721细胞蛋白质组差

29、异表达分析，中国中药杂志，2007，32（9）：831,61,例6实验结果附表 质谱鉴定的差异表达蛋白质点,真核翻译起始因子5A（eIF-5A）：表达下调。抗肿瘤作用的重要靶标，在低分化、12/13密码子K-ras突变、p53核蓄积的肿瘤中高表达。 膜联蛋白A5（Annexin ）：表达上调。一种抗肿瘤增殖的蛋白质。 热休克70103蛋白（HSP70）：表达上调。与肿瘤细胞凋亡相关的蛋白质。 硫氧还蛋白过氧化酶（PRDX2）2：表达下调。一种作用于Bcl-2上游的抗凋亡蛋白。,62,例7,【样 品】多罗清泰颗粒（女贞子 黄芪 灵芝 蒲公英 红景天 藏红花 半支莲 蛇舌草 茯苓 葛根等组成） 【

30、研究目的】在证实多罗清泰颗粒体内实验对小鼠肝癌有抑制作用的基础上，以血清药理学方法和基因芯片技术观察药物对人肝癌细胞信号转导基因表达的影响。 【肿瘤细胞】肝癌SMMC-7721细胞株。 【动 物】SD大鼠，30030g，30只，随机分为3组。 【给药方案】灌胃给药，8、16g/kg（相当于生物等效剂量的4倍和8倍），1次/日，连续10日，末次给药前禁食12小时，给药后1小时摘眼球取血，无菌分离血清。,63,例7,【血清处置】56，30分钟灭活，0.22m微孔滤膜过滤除菌， -20保存。 【实验体系】肝癌SMMC-7721细胞株常规培养。 【血清加量】10%。 【评价方法】基因芯片技术。 【评价

31、指标】基因转录相对丰度分析。 【实验过程】含药血清与肿瘤细胞共同培育48小时， 收集，清洗，裂解细胞；提取并鉴定DNA，制备探针，杂交，化学发光检测，数据分析；RT-PCR验证基因芯片检测结果。,64,例7,【实验结果】多罗清泰颗粒含药血清对所检测的99条信号转导基因中的68条基因表达具有显著影响，占所测基因的69%，其中，上调基因为36条，下调基因为36条，不同剂量组之间的基因表达存在相当大的差异。 【实验结论】多罗清泰颗粒能显著抑制肝癌细胞的生长，能显著影响肝癌细胞信号转导基因的表达。 谢佐福，等：多罗清泰颗粒对人肝癌细胞株信号转导基因表达的影响，中草药，2007，38（5）：720,65

32、,例8,【样 品】半夏泻心方全方（半夏 干姜 黄芩 黄连 人参 大枣 甘草组成）以及6个不同的配伍方（辛开 苦降 辛苦 甘补 辛甘 苦甘组方）。 【研究目的】研究半夏泻心方全方及不同配伍方含药血清对胃癌细胞凋亡的影响及作用机制。 【肿瘤细胞】胃癌BGC-823细胞株 【动 物】家兔，2.0 2.5kg，2只/组。 【给药方案】全方及6种配伍方给药剂量分别为52、20.8、10.4、31.2、20.8、39、31.2g/kg（相当于临床人用剂量的10倍）。 连续灌胃3次， 第1、2次间隔20小时， 第2、3次间隔4小时，实验前禁食12小时。末次给药后2小时无菌条件下心脏采血， 分离血清。,66,

33、例8,【血清处置】56，30分钟灭活， -20保存。经培养证实没有微生物生长。 【实验体系】传代培养胃癌BGC-823细胞，以培养液悬浮成细胞悬液，接种于96孔板，每孔1104个细胞，每浓度设3个复孔。 【血清加量】5%和10%。 【评价方法】MTT法（细胞毒作用评价）、DNA凝胶电泳（细胞凋亡检测）、S-P免疫组化法（Bcl-2基因表达）。 【评价指标】细胞存活率，DNA“梯状带”显示，基因表达阳性细胞率。,67,例8,【实验过程】将含药血清加入到对数生长期的肿瘤细胞实验体系中，分别培育24、48、72小时，尔后，以MTT法测定吸光度，计算细胞存活率。取以含药血清作用48小时的肿瘤细胞进行D

34、NA提取及琼脂糖凝胶电泳。将细胞浓度为2104个/ml的细胞悬液加入到直径为5厘米的培养皿中，并在皿中放置小块玻片先培养24小时，加入含药血清，孵育48小时，取出玻片，清洗，固定，干燥，免疫组化染色。,68,例8,【实验结果】样品全方及不同配伍方对细胞生长的影响结果详见附表。DNA琼脂糖凝胶电泳结果显示，全方、甘补、辛甘、苦甘组含药血清在凝胶电泳中未能见到典型的“梯状带”。辛苦、辛开、苦降组10%含药血清作用的细胞，其凝胶电泳中可见典型的“梯状带”。免疫组化结果显示，未经处理肿瘤细胞的Bcl-2基因产物高表达，在样品全方及不同配伍方含药血清的作用下，Bcl-2的表达受到程度不等的抑制，其中辛苦

35、、辛开、苦降组作用明显，并以辛苦组作用最佳。,69,例8,【实验结论】半夏泻心方中辛开、苦降的配伍形式具有抑制BGC-823细胞增殖，诱导细胞凋亡作用，辛开、苦降配伍后（辛苦）有显著协同增效趋势，而其他配伍药群可能存在拮抗作用。提示辛开苦降法可能是中医药防治胃癌的主要治则治法之一。 刘喜平，等：半夏泻心方配伍与诱导BGC-823 细胞凋亡关系血清药理学研究，中医杂志，2006，47（2）：134,70,例8实验结果附表 半夏泻心方及配伍药组含药血清对BGC-823细胞生长的影响,与空白组同项目比较，P0.05，P0.01；与辛苦组同项目比较，P0.05；与苦降组同项目比较，P0.05；与辛开组

36、同项目比较，P0.05。,71,例9,【样 品】川芎嗪 【研究目的】观察川芎嗪含药血清对人肝癌细胞Hep G2增殖的影响。 【肿瘤细胞】肝癌Hep G2细胞株。 【动 物】SD大鼠，250 300g，10只/组。 【给药方案】川芎嗪143.0、71.5mg/kg，腹腔注射，1次/日，连续7日，末次给药后0.5小时于无菌条件下经股动脉采血，分离血清，同组合并。 【血清处置】0.45m微孔滤膜过滤除菌， 分装，-20保存。 【实验体系】以1104个/ml浓度的Hep G2肿瘤细胞悬液接种于96孔板，200l/孔，每组6复孔。,72,例9,【血清加量】20%、10%、5%。 【评价方法】MTT法，R

37、P-HPLC法。 【评价指标】肿瘤细胞生长抑制率，含药血清中川芎嗪的含量。 【实验过程】在经过24小时细胞培养的96孔板中加入浓度不等的含药血清及空白对照血清，孵育48小时， MTT法测定每孔的吸光度，计算细胞生长抑制率。另一部分高剂量组含药血清将被用来测定川芎嗪的含量。 【实验结果】含药血清对肿瘤细胞生长抑制作用的结果详见附表。川芎嗪含量测定表明，高剂量组大鼠含药血清中其含量为381.5g/ml。,73,例9实验结果附表 川芎嗪含药血清对人肝癌细胞的抑制作用,与空白组比较：P0.05，与生理盐水比较：P0.05。,74,例9,【实验结论】川芎嗪含药血清对人肝癌Hep G2增殖有一定的抑制作用

38、。 丰俊东，等：川芎嗪含药血清对人肝癌细胞Hep G2增殖的抑制作用，中草药，2005，36（4）：551,75,例10,【样 品】剔毒护肝方（黄芪 莪术 组成）全方及其拆方。 【研究目的】探讨剔毒护肝方及其组成药物黄芪、莪术、叶下珠对人肝癌细胞增殖及端粒酶活性的影响。 【肿瘤细胞】肝癌Bel-7402细胞珠。 【动 物】SD大鼠，200 300g，3只/组。 【给药方案】剔毒护肝方全方0.3g/kg，黄芪0.09g/kg，莪术0.09g/kg，叶下珠0.12g/kg分别给不同组别大鼠灌胃给药，2次/日， 连续3日，第4天给予全日剂量后1小时，下腔静脉采血，分离含药血清，同组动物血清混合。,7

39、6,例10,【血清处置】56，30分钟灭活， -70保存。 【实验体系】肿瘤细胞以1105浓度接种于96孔版中，200l/孔。每剂量组设4复孔。 【血清加量】10%。 【评价方法】MTT法测定样品的细胞毒性，PCR-ELISA法测定端粒酶活性。 【评价指标】肿瘤生长抑制率，端粒酶活性抑制率。 【实验过程】肿瘤细胞培养24小时后更换含药血清，孵育48小时，加入MTT，测定吸光度，计算肿瘤生长抑制率；收集各组经含药血清处置的肿瘤细胞，按照试剂盒说明书所述方法进行端粒酶活性测定。,77,例10,【实验结果】详见附表。实验结果表明，剔毒护肝方全方能抑制人肝癌细胞的增殖和端粒酶活性，有一定的抗肝癌作用，

40、进一步拆方研究发现，方中莪术能抑制人肝癌细胞的增殖和端粒酶活性，而叶下珠和黄芪则无此作用。提示剔毒护肝方主要是通过方中莪术来发挥其抗癌作用。 【实验结论】剔毒护肝方具有抑制肝癌细胞增殖的作用，其作用机制之一在于抑制肿瘤细胞端粒酶的活性，该方抗肿瘤的药理作用主要来自于该组方中的莪术。蒋小玲，等：剔毒护肝方及其拆方对人肝癌细胞增殖及端粒酶活性的影响，中西医结合肝病杂志，2004，14（2）：91,78,例10实验结果附表。 含药血清对肿瘤细胞增殖的影响,与对照组比，P0.01。,79,含药血清对肿瘤细胞端粒酶活性的影响,与肿瘤细胞对照组比较，P0.01。,80,8血清药理学研究中存在的问题,（1）实验动物选择无法达到理想状态 （2）含药血清存在缺陷 （3）无法确定最佳给药方案 （4）无法确定最佳采血时间 （5）含药血清是否灭活不统一 （6）血清药理很难做到既保证实验体系药物浓度与血药浓度相等又不影响组织及细胞的生长 （7）药理学实验增加了药物化学工作的难度,81,9血清药理学工作的发展趋势,（1）血清药理学方法的完善，主要是通过基础学研究，对许多不确定的因素进行探索，使得实验尽可能的规范化； （2）与血清药物化学工作相配合，相辅相成，通过血清药物化最终阐明药物作用的物质基础，同时推动血清药理学的进一步发展。,82,谢谢大家,