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1、真菌显微镜标本制备与形态观察技术,酵母菌的血球计数技术,酵母菌的形态观察,实验原理 酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比细菌大几十倍甚至十几倍。大多数以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验是通过美蓝染液水浸片和水碘液水浸片来观察酵母的形态和出芽生殖方式。,美蓝是一种无毒的染料， 它的氧化型呈蓝色，还原型无色。 用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。 因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色， 借此即可对酵母菌的死活细胞进行鉴别
2、。,水浸片法观察,1、菌种活化 将酵母移种至新鲜的麦芽汁琼脂斜面上，2528 培养48 h左右备用。 2、美蓝镜片的观察 1）在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染色掖， 2)然后按无菌操作用接种环挑取少量酵母菌苔放在染液中，混合均匀。 3）用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后 慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。再将多余的染液用滤纸吸干。 4）将制片放置约3min后镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。,5）染色约0.5h后再次进行观察，注意死活细胞数量是否增加。 6）用0.05%吕氏碱性美蓝染液重复上述操作。 3、水一碘液镜片的观察 在载玻片
3、中央加一小滴革兰氏染色用碘液，然后在其上加3小滴水，取少许酵母菌苔放在水一碘液中混匀，盖上盖玻片后镜检。 注意事项 1、加染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡而影响观察。 2、盖玻片不宜平着放下，以免产生气泡影响观察。,酵母菌的出芽生殖,蜉蝣体表面的酵母菌,霉菌的形态观察,实验原理 霉菌为真核微生物，菌丝较粗大，有分枝或不分枝的。菌丝体为五色透明或暗褐色至黑色，或呈现鲜艳的颜色。在显微镜下观察时，菌丝皆呈管状。在固体培养基上生长，为绒毛状或棉絮状。一些较高等的霉菌丝状管道中皆有横隔，由横格状菌丝隔成许多细胞。细胞易收缩变形，而且孢子很容易分散，所以制标本时常用乳酸
4、石炭酸棉蓝染色液。该染色液使细胞不变形，具有防腐杀菌作用，且不易干燥，能保持较长时间，溶液本身呈蓝色，有一定的染色效果。,水浸片法观察,1）取一块洁净的载玻片，于载玻片的中央加一滴美蓝染色液， 2）按无菌操作用接种环挑取少量酵母菌苔放在染液中，混合均匀。 3）用洁净的加盖玻片轻轻盖上，注意不要产生气泡， 4）置于显微镜下观察，菌丝呈兰色，颜色的深度随菌龄的增加而减弱。,各种霉菌的形态结构,观察根霉时，注意观察其菌丝有无横隔、假根、孢子囊柄、孢子囊、囊轴、囊托、孢子囊孢子及厚垣孢子。 观察毛霉时，注意观察其菌丝无横隔、孢子囊柄、囊轴、孢子囊孢子及后垣孢子。 观察曲霉时，注意观察其菌丝有横隔、足细
5、胞、分生孢子梗、顶囊、小梗（形状、层数及着生情况）、分生孢子。 观察青霉时，注意观察其菌丝有横隔、分生孢子梗、帚状枝（小梗的轮数及对称性）、分生孢子。 观察红曲霉时，注意观察其菌丝有横隔、分生孢子着生情况、闭囊壳、子囊孢子。,曲霉的形态,米曲霉,黑曲霉,酵母菌的血球计数技术,血球计数板,酵母菌的血球计数,(1)将血球计数板用擦镜纸擦净,在中央的计数室上加盖盖玻片. (2)将稀释后的酵母菌悬液,用吸管吸取一滴置于盖玻片的边缘,使菌液缓缓渗入,多余的菌液用吸水纸吸取,捎待片刻,使酵母菌全部沉降到血球计数室内.,计数原则,(1)计数时, 如果使用16格25格规格的计数室,要按对角线位,取左上,右上,
6、左下,右下4个中格(即100个小格)的酵母菌数. 如果规格为25格16格的计数板,除了取其4个对角方位外,还需再数中央的一个中格(即80个小方格)的酵母菌数.,(2)当遇到位于大格线上的酵母菌,一般只计数大方格的上方和右方线上的酵母细胞(或只计数下方和左方线上的酵母细胞). (3)对每个样品计数三次,取其平均值,按下列公式计算每1ml菌液中所含的酵母菌个数.,3.计算公式,(1)16格25格的血球计数板计算公式: 酵母细胞数/ml=100小格内酵母细胞个数/10040010000稀释倍数 (2)25格x16格的血球计数板计算公式: 酵母细胞数/ml= 80小格内酵母细胞个数/8040010000稀释倍数,单位转换,0.1mm31mL3 0.1mm3100001mL3,血球计数板的清洁,血球汁数板使用后,用自来水冲洗,切勿用硬物洗刷,洗后自行晾干或用吹风机吹干,或用95%的乙醇,无水乙醇,丙酮等有机溶剂脱水使其干燥.通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物.若不干净,则必须重复清洗直到干净为止.,演示结束！,希望各位多多指教！,