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1、研究生科研实验教学基地建设 基本实验技能培训,首都医科大学附属北京朝阳医院 基础医学研究中心 梁燕 85231624, ,主要内容,1.DNA的提取 DNA提取原理 DNA提取方法 操作注意事项,2.PCR PCR体系和循环条件 PCR操作步骤 操作注意事项,3.琼脂糖凝胶电泳 凝胶电泳原理 电泳方法步骤 操作注意事项,1.DNA的提取 DNA提取原理 DNA提取方法 操作注意事项,1.1 基因组DNA提取原理,既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离， 又要保持DNA分子的完整。,仪器准备： 台式离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、移液器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）、镊子（灭菌）、离心管架
2、试剂准备： 试剂盒、无水乙醇等,1.2 基因组DNA提取,试剂盒,试剂盒内容,操作步骤（重点）,向52ml的缓冲液GD中加入68ml无水乙醇，并标记；向50ml的缓冲液PW中加入200ml无水乙醇，并标记； 取200ul全血，加入20ul的蛋白酶K溶液，混匀； 加入200ul缓冲液GB，充分颠倒混匀，56放置10分钟，期间颠倒混匀数次，溶液应变清亮。 加入200ul无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀。 将吸附柱CB3放入收集管中准备好，将上述溶液移到吸附柱CB3中，12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管；如果步骤5的溶液不能一次加完，可以再次重复步骤6；
3、 向吸附柱中加500ul的缓冲液GD， 12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管；,操作步骤（重点）,7. 向吸附柱中加入700ul漂洗液PW， 12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管； 向吸附柱中加入500ul漂洗液PW， 12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管； 将吸附柱和收集管再次离心， 12000rpm离心2分钟，将吸附柱至于室温放置数分钟； 将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50-200ul洗脱缓冲液TB，室温放置2-5分钟， 12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中； 测
4、OD值，计算DNA浓度和纯度；或电泳估计DNA浓度。,计算公式： OD260/OD280=1.7-1.9 DNA浓度(ug/ul)=OD26050稀释倍数/1000 OD260=0.1 稀释倍数=250 DNA浓度=0.150 250/1000=1.25 ug/ul,操作注意事项,避免样品反复冻融,56水浴摇匀可消除GB中的沉淀,使用台式离心机，室温离心,2.PCR PCR体系和循环条件 PCR操作步骤 操作注意事项,仪器准备： PCR仪，微型离心机、移液器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）、镊子（灭菌）、离心管架 试剂准备： ddH2O, PCR Buffer，dNTP，引物，PCR聚合酶，DN
5、A模板,2.1 PCR体系和循环条件（重点）,95，30s （预变性）,72 ，30s （后延伸）,30cycles,2.2 PCR操作步骤（重点）,计算好所需扩增的PCR体系； 打开PCR仪预热，设置PCR循环条件； 准备试剂，融化，离心，置于冰上，备用； 按顺序加样，混匀，离心，分装； 加入模板DNA，混匀，离心； 放入PCR仪，Start。,2.3 PCR操作注意事项,避免试剂反复冻融,计算总量，顺序加样,更换吸头，避免污染,3.琼脂糖凝胶电泳 凝胶电泳原理 电泳方法步骤 操作注意事项,3.1 琼脂糖凝胶电泳原理,DNA分子带负电荷，在直流电场中由负极移向正极； 其移动速度与线性DNA片
6、段长度成反比。,配置1%的胶：称1g琼脂糖于适当大小三角瓶中，倒入100ml的1*TAE，微波炉加热至完全融化； 待凝胶温度降至50-60度时，加入1ul的EB（10mg/ml)，摇匀，将胶倒入放好梳子的电泳板中，自然冷却30-60分钟； 轻轻拔掉梳子，将胶放入电泳槽中，倒入1*TAE，没过加样孔； 按照1ul上样Buffer+5ul的DNA混合后，点样；每排留一个孔加DNA marker； 100V电泳30分钟，凝胶成像仪照相。,3.2 琼脂糖凝胶电泳方法（重点）,3.3 电泳操作注意事项,带手套操作EB,凝胶冷却时间至少30分钟,凝胶完全融化,M II-3 II-2 II-1 I-2 I-1 0,应用BclI/RFLP 多态位点进行基因连锁分析,374,211,163,小 结,1.DNA的提取 DNA提取原理 DNA提取方法 操作注意事项,2.PCR PCR体系和循环条件 PCR操作步骤 操作注意事项,3.琼脂糖凝胶电泳 凝胶电泳原理 电泳方法步骤 操作注意事项,作 业,实验记录 姓名，日期，试剂批号等 实验设计 DNA提取步骤 PCR体系和循环条件 配胶和电泳方法,