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1、实验十六 紫外吸收法测定核酸含量 目的要求 学习紫外线（UV）吸收法 测定核酸浓度 的原理。,实验原理 核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（CC一CC 一），能够强烈吸收250280nm 波长的紫外光。核酸（DNA，RNA）的最大紫外吸收值在260nm 处。在此波长处，核酸溶液的吸光率与其含量成正比关系，可用于定量测定。,实验原理 采用紫外分光光度法测定核酸含量时，通常规定：在260nm 波长下，浓度为1g/mL 的 DNA 溶液其光密度为0.020，而浓度为1g/mL 的RNA 溶液其光密度为0.024。因此，测定未知浓度的DNA（RNA）溶液的光密度OD26
2、0nm，即可计算测出其中核酸的含量。该法简单、快速、灵敏度高。,试剂和器材,1试材：核酸样品DNA 或RNA 2 主要仪器 ： （1）分析天平 （2）紫外分光光度计 （3）冰浴或冰箱 （4）离心机 （5）离心管（10mL） （6）烧杯（10mL） （7）容量瓶（50mL、100mL） （8）移液管（0.5ml、2mL 和5mL） （9）药品勺和玻璃棒 （10）试管和试管架。 3试剂 ： （1）5%6%氨水：用25%30氨水稀释5 倍。 （2）钼酸铵-过氯酸试剂：取3.6mL70%过氯酸和0.25g 钼酸铵溶于96.4mL 蒸馏水中。,1.准确称取待测核酸样品0.5g，加少量0.01mol/L
3、NaOH调成糊状,再加适量水，用5-6%氨水调至pH7.0，定容至50mL。 2.取两支离心管，甲管加入2mL样品溶液和2mL蒸馏水，乙管加入2mL样 品溶液和2mL沉淀剂。混匀，在冰浴上放置30min。 3.在3000r/min下离心10min。从甲、乙两管中分别吸取0.5 mL上清液，用蒸馏水定容至50mL。选择厚度为1cm的石英比色杯，在260nm波长处测定A值。 4.测定A280的值。求出A260/A280.判断RNA的纯度。 RNA=A260/A280=2.0,操作方法,二、计算公式 A260 RNA浓度 = x N 0.024 x L 式中， A260为甲管稀释液在260nm波长处
4、A值减去乙管稀释液在260nm波长处A值； L 比色杯的厚度，1cm； N 为稀释倍数； 0.024每毫升溶液内含1gRNA的A值； 1mL待测样品液中核酸（微克） 核酸 1mL待测样品液中制品的毫克数 在本实验中，1mL待测液中制品量为50g。,1. 紫外分光光度计使用前要预热。 2. 比色皿应成套使用，注意保护,不能拿在光面上。 3. 离心机使用前必须将离心管平衡，对称放置。调速必须 从低到高，离心完等转子完全停下后，再打开盖子，然 后将转速打到最低。,注意事项,用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，具有简单、快速、灵敏度高的优点，并且待测核酸样品中含有的微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质，产生较小测定误差。但该法在测定样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质时，则会产生较大测定误差，需要设法事先除去。 当样品中含有核苷酸类杂质时，需要加钼酸铵-过氯酸沉淀剂处理，沉淀除去大分子核酸，测定上清液260 nm处光密度，以此作为对照；再从未加沉淀剂测得的样品液260nm光密度中扣除。,