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1、,转基因大豆？,专题一 基因工程,第1讲 DNA重组技术的基本工具,温故知新：核酸的类型,概念：细胞内携带遗传信息的物质，在生物体的遗传、 变异和蛋白质的生物合成中具有极其重要的作用。,脱氧核糖核酸(DNA),核糖核酸(RNA),基本单位：,脱氧核糖核苷酸,核糖核苷酸,碱基种类：,A、G、C、T,基本单位：,碱基种类：,A、G、C、U,类型,温故知新：核酸的空间结构,1. DNA分子是由两条反向平 行的脱氧核苷酸长链盘旋成 的双螺旋结构,2. DNA分子中的脱氧核糖和 磷酸交替连接,排列在外侧,构 成基本骨架;碱基排列在内侧,3. 两条链上的碱基通过氢键连接起来,形成碱基对,且遵循碱基互补配对
2、原则。,温故知新：基因,概念：基因是有遗传效应的DNA片段，是生物体遗传的 结构单位和功能单位。 作用：控制生物性状，指导蛋白质的生物合成。,温故知新：基因工程,概念：基因工程又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。 通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种 基因提取出来，加以修饰改造，然后转入到另一种生物 的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。也称为转基因技术。,原理：基因重组,优点： 克服了远缘杂交不亲和的障碍； 周期短；目的性强,为什么能把一种生物的基因“嫁接”到另一种生物上并成功表达？,1、大多数生物的遗传物质都是DNA，且主要为双螺 旋结构，即不同生物的DNA分子基本结构是相同的，
3、都遵循碱基互补配对原则 。所以不同的生物DNA可 以嫁接。 2、地球上的所有生物共用一套遗传密码，所以，一 种生物的基因可以在另外一种生物体内得以表达。,思考与讨论,基因工程的应用之一：,生产胰岛素,（复习糖尿病相关知识）,人的细胞,提取,胰岛素基因,与运载体DNA拼接 导入,上述生产胰岛素的关键步骤是什么？,细菌(含胰岛素基因),生产胰岛素,基因工程生产胰岛素简要过程：,胰岛素基因的获取,胰岛素基因导入受体细胞,胰岛素基因与运载体连接,基因工程生产胰岛素的关键步骤：,基因的“剪刀”限制性内切酶,基因的“针线”DNA连接酶,基因的运输工具运载体,基因工程的操作工具,操作工具,大肠杆菌的一种EC
4、ORI限制酶识别GAATTC序列， 并在G和A之间切开）。,基因的“剪刀”限制性核酸内切酶,基因工程的操作工具,基因工程的操作工具,基因的“剪刀”限制性核酸内切酶,酶切位点：特定序列核苷酸的磷酸二酯键,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,黏性末端：,黏性末端,基因工程的操作工具,不同的限制性内切酶得到的黏性末端不同,中轴线,在G与C之间切割,SmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。,SmaI限制酶的作用,平末端：当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口是平整的，这样的切口叫平末端。,平末端
5、 平末端,SmaI限制酶的作用,EcoR,中轴线,Sma,黏性末端,平末端 平末端,黏性末端,仔细观察各限制酶识别的特定序列有何特点？,限制酶的识别序列,限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列,限制酶的识别序列,同一种内切酶要切两个切口，产生四个黏性末端。,会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。,Q1：要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？,Q2：如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来
6、切割，会怎样呢？,思考与讨论,基因的针线DNA连接酶,DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来(形成磷酸二酯键)，这样一个重组的DNA分子就形成了。,(连接“梯子”断口的“扶手”而非“梯子”中间的“踏板”),基因工程的操作工具,DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？,T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低,基因工程的操作工具,A A T T G,C,A,A,T,T,A,A,T,T,基因工程的操作工具,都能催化形成磷酸二酯键,都是蛋白质,不需要,需要,形成完整的重组DNA分子,形成DNA的一条链,基因工程,DNA复制,只能将单个核苷
7、酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键,在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,DNA连接酶与DNA聚合酶的比较,质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的环状双链DNA分子。,质粒、噬菌体、动植物病毒,基因的运输工具运载体,运载体的种类：,基因工程的操作工具,在宿主细胞中能保存下来并能大量复制。 有多个限制酶切点，以便与外源基因连接。 具有标记基因，以便进行筛选。 对受体细胞无害、易分离。 载体DNA分子大小应适合，便于提取和操作。,运载体的作用：,运载体必须具备的五个条件：,作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中 利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制,基因工程的操作工具,大肠杆
8、菌的质粒：,最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如抗四环素的标记基因。质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内完成。,基因工程的操作工具,目的基因所在片段,CTTAA,G,CTTAA,G,CTTAA,CTTAA,G,G,PSt ,目的基因与运载体连接,pBR322质粒结构,标记基因,进行筛选,限制性内切酶,识别序列,外源基因连接,通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防
9、止外源DNA的入侵。,Q3：为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？,思考与讨论,原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。,Q4：你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？,思考与讨论,不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：,Q5：天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？,思考与讨论,在宿主细胞中能保存下来并能大量复制。 有多个限制酶切点，以便与外源基因连接。 具有标记基因，以便进行筛选。 对受体细胞无害、易分离。 载体DNA分子大小应适合，便于提取和操作。,天然的质粒要进行人工改造后才能用于基因工程操作,迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力。具体原因尚不明确，有待研究。,Q6：DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？,思考与讨论,