目的基因的制备.ppt

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1、2019/3/14,1,第五章 目的基因的制备,第一节 目的基因的制备 第二节 目的基因的分离,2019/3/14,2,一 概 述,基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因。,目的基因,确定其表达调控机制和生物学功能,建立高效表达系统,构建具有经济价值的基因工程菌（细胞）,体外进行必要的结构功能修饰,输回细胞内改良生物体遗传性状，包括人体基因治疗,2019/3/14,3,二 什么是目的基因,基因工程的主要目的是使优良性状相关的基因聚集在同一生物体中，创造出具有高度应用价值的新物种。为此必须从现有生物群体中，根据需要分离出此类基因，即准备要分离、改造、扩增或表

2、达的基因通常称之为目的基因。 如抗逆性相关基因（抗病、抗寒等）、生物药和保健品相关基因、毒物降解相关基因 、工业用酶等相关基因等。,2019/3/14,4,一般来说，目的基因的制备战略分为两大类 一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆； 另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。,2019/3/14,第一节 目的基因的制备,5,第一节 目的基因的制备,1、直接法制备基因 2、从基因组文库中钓取目的基因 3、从cDNA文库中钓取目的基因 4、通过PCR直接扩增出目的

3、基因,2019/3/14,6,1.1 限制性核酸内切酶酶切分离法,限制性内切酶酶切分离法适于从简单基因组（如质粒和病毒）中分离目的基因。 对已定序的DNA分子，只需用已知识别序列的限制性核酸内切酶进行一次或几次切割，分离纯化所需DNA片段，与适当载体重组后转化受体菌后即可得到目的基因的克隆。 对已知定位的目的基因，只要根据目的基因两侧的已知的限制性内切酶识别位点，用适当的限制性内切酶切割，一次就可获得目的基因。,2019/3/14,7,所谓基因就是具有特定生物学功能的一段核苷酸序列，所以只要掌握了其分子结构，完全可以在实验室进行人工合成。 1977年，利用化学途径首次合成了编码脑激素的基因（生

4、长激素释放因子基因），并在大肠杆菌中实现了成功的表达。从此，化学合成基因得到了很大的发展迅速。,早期通过化学合成的部分基因,基因 人胰岛素 转运RNA -干扰素 肠促胰液肽 尿抑胃激素 -干扰素,大小（bp） 126 542 81 162 453,合成年代 1978 1979 1981 1982 1982 1984,基因 视紫红质 前脑菲肽 ATP酶 溶菌酶 RNA酶T1 RNA酶,大小（bp） 1057 77 170 385 324 375,合成年代 1985 1985 1985 1985 1986 1987,1.2 化学法直接合成基因,2019/3/14,8,1.2.1.1小片段粘接法：,

5、混合退火,根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段,T4-DNA连接酶连接,克隆入合适的载体,1.2.1 化学合成法的基本战略,全基因合成有三种战略：,2019/3/14,9,混合退火,T4-DNA连接酶连接,克隆入合适的载体,Klenow酶聚合,1.2.1.2 补钉延长法,根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段,2019/3/14,10,根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段,混合退火,T4-DNA连接酶连接,克隆入合适的载体,Klenow酶聚合,1.2.1.3 大片段酶促法

6、,2019/3/14,11,1.2.1.4 三种方法各有利弊,化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%,2019/3/14,12,1.2.2 化学合成的单元操作,化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。 从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷

7、酸三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，DNA合成仪就是根据固相亚磷酸三酯法原理设计的,2019/3/14,13,O,H,G,H,H,H,H,O,CH,2,O,DMT,P,O,Me,N,CH,Me,Me,CH,Me,Me,H,激活,缩合,氧化,脱取代基,玻璃珠,化学合成的单元操作,DMT： 二甲氧基三苯甲基,连接臂,2019/3/14,14,合成天然基因,修饰改造基因,设计新型基因,制备探针、引物、接头,1.2.3 DNA化学合成的用途,如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等,如组织型纤溶酶原激活剂

8、基因、尿激酶原基因等,2019/3/14,第一节 目的基因的制备,15,第一节 目的基因的制备,1 直接法制备基因 2 从基因组文库中钓取目的基因 3 从cDNA文库中钓取目的基因 4 利用PCR直接扩增出目的基因,2019/3/14,16,对于高等真核生物而言，基因组DNA庞大，组成结构复杂，存在间隔序列和重复序列，因此，单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，大多数基因难以直接分离得到。 为了解决这个难题，可行的方法就是将这个基因扩增，增加成功分离目的基因的可能性。 但是由于要分离的目的基因往往是未知基因，因此无法对它进行特异性扩增,而只能对所有的基因进行扩增，也就是构建该生物材料的

9、基因组文库。然后再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来。,2019/3/14,第一节 目的基因的制备,17,2、从基因组文库中钓取目的基因,2.1基因文库的构建 2.1.1基因文库的基本概念 基因库(gene pool):特定生物体全基因组的集合（天然存在） 基因文库(gene library or gene bank):从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）一个受体菌的群体之中 , 这个群体即为这种生物的基因文库。 根据构建方法的不同，基因文库分为:基因组文库（含有全部基因）； cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）,2019/3/14,第一节 目的基因的制

10、备,18,2.1.2 基因文库构建的材料来源,材料来自染色体DNA或mRNA 在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA文库等。很显然， cDNA文库的信息量远小于基因组文库种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库,2019/3/14,19,2.1.3 基因文库的完备性,基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示： 其中：P=任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率， f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小,N = ln ( 1

11、 P ) / ln ( 1 f ),例如，人的单倍体DNA总长为2.9 x 109 bp，基因文库中克隆片段的平均大小为15 kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180万个克隆,2019/3/14,20,For example : 期望值为0.99，插入片断为20kb的 E.coli (4.6106 bp) 和 human (3109 bp) 基因组的克隆数的计算 N E.coli= =1.1 103,ln( 1-0.99),ln1-(2104/4.6106),Nhuman= = 6.9 105,ln(1-0.99),l

12、n1-(2 104/3 109),这个例子说明用质粒载体（插入片段5-10kb）就可以建立很好的原核生物基因文库，只需要几千个克隆；而真核生物则需要更大承载能力的载体。,2019/3/14,第一节 目的基因的制备,21,2.1.4基因文库的质量标准,除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件： 重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力 载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序 克隆片段易于从载体分子上完整卸下 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选,2019/3/14,22,2.1.5基因文库的构建技术路线,材料的选择

13、及基因组DNA的制备； 载体的选择； 载体与基因组DNA的限制性酶切； 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞； 重组克隆的筛选和保存。,2019/3/14,第一节 目的基因的制备,23,2.1.5.1 基因组DNA的制备,文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。 制备的DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高,用常规方法制备的染色体DNA的长度一般在100 kb左右。如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有SDS、蛋白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1000 kb大小的DNA片段,2019/3/14,第一节

14、目的基因的制备,24,2.1.5.2 载体的选择,出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体。由于绝大多数真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒。上述几种载体的最大装载量如下：,l-DNA,质粒,考斯质粒,10 kb,23 kb,45 kb,BAC,300 kb,用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌,2019/3/14,第一节 目的基因的制备,25,2.1.5.3 载体与基因组DNA的切割,用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处

15、理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是： 第一 保证DNA片段之间存在部分重叠区。 第二 保证DNA片段大小均一。 超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头。 部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，这样DNA酶解片段的大小可控。 连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体。,2019/3/14,第一节 目的基因的制备,26,2.1.5.4 载体与外源片段的连接 （1） 连接酶,DNA连接酶；T4 DNA连接酶；E.coli DNA连接酶 它们都可以催化5末端磷酸和3末端羟基形成磷酸二酯键。 但由于T4 DNA连接

16、酶既能连接粘性末端还能连接平末端，而E.coli DNA连接酶主要连接粘性末端，所以一般连接反应中都用T4 DNA连接酶。,2019/3/14,第一节 目的基因的制备,27,（2）连接反应的效率,连接反应的效率和连接产物的组成与DNA末端的特性、DNA末端的浓度以及所用的连接酶量有关。 平末端连接反应的效率相对较低，它需要较高浓度的平末端、较大的连接酶量、较低浓度的ATP以及不能有象亚精胺一类的多胺。 在连接反应中加入15的PEG 8000或11.5pmolL 氯化六氨合钴等浓缩剂可极大地促进平末端反应的连接速度，同时可改变不同连接产物的比例，使连接产物增多。,2019/3/14,第一节 目的

17、基因的制备,28,（3）避免外源DNA片段之间的连接措施,在基因组文库的构建过程中，最应引起重视的问题是：严禁外源DNA片段之间的连接！ 为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合： 将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离 用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基团 用酶在DNA片段的末端上增补同聚尾末端,2019/3/14,第一节 目的基因的制备,29,2019/3/14,第一节 目的基因的制备,30,2.1.5.5 重组DNA导入宿主及筛选,转化 转导 转染 感染 结合 其它,2019/3/14,31,密集铺板（1-10万）,杂交,挖取,目的重组克隆,铺板,铺板,2019/3/1

18、4,第一节 目的基因的制备,32,构建噬菌体基因组文库的主要步骤,2019/3/14,第一节 目的基因的制备,33,用粘粒载体建立基因组文库的主要步骤,2019/3/14,第一节 目的基因的制备,34,2.1.5.6 基因组文库重组克隆的排序,大型基因文库（包括人的基因文库）的构建在技术上并不十分困难，如果一个YAC基因文库的插入片段总和为整个基因组的十倍以上时，一般就能从基因文库中调出任何一段DNA序列。 然而基因文库的克隆都是随机序列，必须将所有的克隆排列成一个像天然染色体DNA上所表现出的信息顺序。这项工作的工作量可能远大于基因组文库的构建，属于基因文库的后期制作,2019/3/14,第

19、一节 目的基因的制备,35,（1）酶切片段末端标记法,将单一的YAC克隆插入DNA片段用限制性内切酶分布均匀地水解成若干片段，末端标记同位素。 然后再用Sau3A I或Mbo I将末端标记的DNA片段降解成碎片，聚丙烯酰胺凝胶电泳，每10个YAC克隆走在同一块板上，形成10个克隆的特征性DNA指纹图谱 电脑分析指纹图谱，如发现任何两个克隆DNA的指纹图谱有部分相同的，则其两个YAC片段就有互相重叠的可能性，于是这两个YAC克隆的DNA片段克隆在染色体上是排列一起的,2019/3/14,第一节 目的基因的制备,36,H,H,H,H,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,

20、S,S,S,单一克隆指纹图谱,十克隆指纹图谱,载体DNA,克隆DNA,2019/3/14,第一节 目的基因的制备,37,（2）随机探针联合杂交法,将若干YAC克隆固定在薄膜上，并复制二十份薄膜；合成20种不同序列的短探针，其序列是随机的。 用20种探针随机定位杂交（一对一）20份YAC克隆薄膜。 如果某两个克隆同时对同一种探针呈现杂交阳性反应，则这两个克隆有可能是相互重叠的。若将杂交阳性结果记为“1”，而阴性结果记为“0”，可清晰地列成一张表，最终排出上述YAC克隆的排列顺序 。,2019/3/14,38,01,02,03,04,05,06,07,08,09,10,11,12,13,14,15

21、,16,17,18,19,20,A B C D E F G,01,02,03,04,05,06,07,08,09,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,D,A,B,C,E,F,G,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,2019/3/14,39,01,04,12,06,13,14,02,17,07,19,11,15,05,08,16,03,10,09,20,18,D,A,B,C,E,F,G,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1

22、,1,1,1,1,1,F,C,A,D,G,E,B,2019/3/14,40,（3）染色体走读法（chromosome walking）,从基因文库中任取一个克隆作为染色体走读的起点，将之两端序列分别亚克隆，亚克隆片段在0.5 2.0 kb范围内 分别以上述亚克隆DNA片段为探针，杂交同一基因文库，杂交阳性克隆中的插入DNA片段必定与起点克隆所含的DNA片段连锁在一起 然后再以阳性克隆片段的两端序列为探针，进行第二步走读，直至线型染色体DNA的端点,2019/3/14,41,染色体走读法（chromosome walking）,走读的起点克隆片段,亚克隆旁测序列,探针标记,第一轮杂交,阳性克隆,

23、阳性克隆,第二轮杂交,第二轮杂交,2019/3/14,42,染色体走读法（chromosome walking）,走读的起点克隆片段,2019/3/14,43,2.1.5.7 从基因组文库中钓取目的基因,构建了基因文库仅仅是完成了基因克隆，并不等于完成了基因分离。构建成的文库仅是一个杂乱无章的“基因图书馆”，要想从中找到所需基因，必须有一些相关线索。分离目的基因也要知道与目的基因有关的某些或某个特征，才能据此找到相关基因。主要方法有： 核酸杂交方法； 免疫学检测方法； DNA同胞选择法（极少用）； PCR筛选法； 其他方法。,2019/3/14,44,（1）核酸杂交方法,适用于大量筛选，常用，

24、可靠。但需制备探针，所用探针有多种，获得探针的方法很多；,（2）免疫学检测方法,（3）DNA同胞选择法（极少用）,使用抗体探针，通过检测重组克隆表达出的蛋白质来筛选目的克隆。只适用于表达文库的筛选，并只能筛选出表达了的克隆。,DNA同胞选择法是按矩阵分值亚库，用mRNA与cDNA杂交后释放出mRNA ，使其在无细胞蛋白合成体系中翻译，并对翻译产物进行免疫沉淀、PAGE电影鉴定或活性分析等来筛选目的快乐，该方法要求全长cDNA，一般只在无其他方法可用或表达产物很小时才用,2019/3/14,45,（4）PCR筛选法,其显著特点是快速、简便。该方法的基本策略是采用“反应池” ，将基因文库分装96孔

25、培养板，如有2304个克隆分别置于24个96孔培养板中，现以反应板为单位，将96个克隆混合成一个“反应池”，进行一个PCR反应，如图：,2019/3/14,46,从24个反应板中找出具有阳性克隆的反应板，再将该板中的12个横向克隆与8个纵向克隆分别混合，形成12个横向池及8个纵向池，进行20个（8+12）反应，如图，横向阳性池与纵向阳性池交叉的孔为阳性单克隆，通过44个反应可从2304个克隆中筛选分离出单个克隆。,2019/3/14,47,大肠杆菌作为寄主进行DNA克隆的实验方案,DNA片段 的获得,载体构建,细菌转化,重组体 的鉴定,限制性内 切酶消化,机械切割,双链cDNA 的合成,化学法

26、 直接合成,同聚物 加尾,粘性末端 连接,平末端 连接,加接头造成 粘性末端,重组噬菌体 DNA转染,重组质粒 的转化,体外包装 进行转导,表型鉴定,核酸杂交,免疫学分析,酶切鉴定,2019/3/14,第一节 目的基因的制备,48,2.1.5.7从基因组文库中钓取目的基因总结图,图克隆策略的一般总结，箭头显示了最佳路线。注意，在以细胞为基础的克隆策略中，DNA最初是由非特异性的方法并克隆的，因此在结尾步骤需要筛选出目标克隆。相反地，当特异性的DNA片段是通过PCR或直接化学合成的方式获得的时候，也就不需要后续的筛选了。,2019/3/14,第一节 目的基因的制备,49,第一节 目的基因的制备,

27、1、直接法制备基因 2、从基因组文库中钓取目的基因 3、从cDNA文库中钓取目的基因 4、通过PCR直接扩增出目的基因,2019/3/14,第一节 目的基因的制备,50,3 从cDNA文库中钓取目的基因,3.1 cDNA文库的构建 3.2 cDNA克隆的操作流程,2019/3/14,51,3.1.1. cDNA,以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。,3.1.2. cDNA library,mRNA,cDNA,3,3,5,5,反转录酶,引物,利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。,3.1 cDNA文库的构建,201

28、9/3/14,52,（1）不含内含子序列。 （2）可以在细菌中直接表达。 （3）包含了所有编码蛋白质的基因。 （4）比DNA文库小的多，容易构建。,3.1.4. 构建cDNA文库的一般步骤,（1）总RNA（total RNA）提取,3.1.3. cDNA文库的特点,提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。,2019/3/14,53,分离mRNA用商业化的Oligo dT纤维柱。,利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。 mRNA只占总RNA的1%-2%。,（2）mRNA的分离纯化, 原理, mRNA的分离纯化,Column（柱）,2019/

29、3/14,54,2019/3/14,55,反转录酶,（3）cDNA的合成, cDNA第一链合成,逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。 用Oligo dT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。,mRNA,cDNA,3,5,5,AAAAAAA,TTTTTTT,Oligo dT引物,2019/3/14,56,用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。,mRNA,cDNA,3,3,5,5,反转录酶,引物,mRNA,cDNA第一链,3,3,5,5,引物,cDNA第一链,3,5,引物, 降解mRNA模板,或RNaseH,碱,2019/3/14,57,剩下的cDNA单链的3末端

30、一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA.。,cDNA第一链,5,cDNA第二链合成,DNA聚合酶,cDNA第一链,cDNA第二链,5,3, cDNA第二链合成,2019/3/14,58,去掉发卡结构,核酸酶S1,用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）。,cDNA第一链,cDNA第二链,5,3,cDNA第一链,cDNA第二链,5,3,5,3,2019/3/14,59,在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。 或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3端分别加上几个C或G，成为

31、粘性末端。,3.1.5.cDNA与载体连接：,接上人工接头,粘性末端,CCC,CCC,末端转移酶,2019/3/14,60,2019/3/14,61,3.2 cDNA克隆的操作流程,随着cDNA从克隆经验的积累和方法的不断改进，逐渐形成了下列相对成熟和标准的构建cDNA文库的操作流程。 转录酶以oligo(dT)为引物合成cDNA第一链。 用RNase H和大肠杆菌聚合酶等合成cDNA第二链。 cDNA的甲基化(非必需步骤)。 cDNA与接头连接，并经限制酶消化产生黏性末端。 cDNA的分部收集(非必需步骤)。 cDNA与末端匹配的载体连接。 重组cDNA导人宿主菌。,2019/3/14,第一

32、节 目的基因的制备,62,第一节 目的基因的制备,1、直接法制备基因 2、从基因组文库中钓取目的基因 3、从cDNA文库中钓取目的基因 4、通过PCR直接扩增出目的基因,2019/3/14,第一节 目的基因的制备,63,4 通过PCR直接扩增出目的基因,前提:目的基因的全序列或其两侧序列为已知，合成一对与模板DNA互补的引物，扩增出DNA片段。 模板：基因组DNA，mRNA序列，或是已克隆到某一载体上的基因片段。为了克隆操作的方便或保证克隆后续工作需要，常常要在设计引物时对其两端作一些修饰，如 带限制性内切酶切点,某种启动子序列或起始或终止密码等,便于下一步的重组克隆和基因的表达和调控研究。,

33、2019/3/14,64,通过PCR直接扩增出目的基因策略,2019/3/14,第一节 目的基因的制备,65,优缺点：与传统的DNA克隆方法比较，省时、省力, 但要求待扩增的DNA片段的序列必需是已知的，至少要求两端长约20bp的序列是已知的。另外，合成的DNA片段长度有限，一般在2kb以内，超过2kb时扩增效果显著下降。 如要大量扩增未知序列的特异DNA片段，或是更长的DNA片段，则须选择特殊类型的PCR策略。通常PCR反应有如下几种类型:,2019/3/14,66,4.1 套式 PCR（nested PCR）,也叫巢式PCR，是指用两对引物扩增同一样品的方法。即在两对引物中，一对引物与靶序

34、列的复性结合位点处于另一对引物扩增的DNA序列内，前者称为内部引物，后者称为外侧引物。一般先用外侧引物扩增一段较长的靶序列，然后以第一次扩增的产物为模板，再用内部引物扩增其中的部分片段。 套式 PCR较常规PCR灵敏度大大提高，同时也有较强的的特异性，假阳性极少。,2019/3/14,第一节 目的基因的制备,67,4.2 反向 PCR(inverse PCR),当一个未知序列位于已知序列的上游，一般可用已知靶序列的一个引物( 即与3端互补的引物)进行单向PCR线性扩增, 而反向PCR技术则可利用二个靶序列引物对未知片段进行常规PCR扩增。反向PCR包括下列三个步骤,2019/3/14,第一节

35、目的基因的制备,68,首先，用限制性核酸内切酶消化待测线性DNA模板。 其次，使酶切后的线性 DNA 模板连接成为环状分子，或加上衔接头后再连接成环状。 第三，用另一种限制酶消化，将环状DNA从已知区域中间切开，则线性化DNA的两侧为已知序列，未知区域夹在中间，用与已知区域可使未知序列大量扩增出来。,2019/3/14,第一节 目的基因的制备,69,4.3 锚定 PCR(anchored PCR),锚定PCR，又称为单侧PCR，是指通过添加锚定引物接头的方式来扩增合成未知序列或未全知序列的方法。 常见的锚定PCR类型是利用未知序列中一小段已知序列的信息来扩增合成已知序列上游或下游片段，最后获得

36、全部序列。,2019/3/14,第一节 目的基因的制备,70,其基本步骤,与此po1y(dG)相对应的poly(dC)即为锚定引物。 为保证扩增特异性，锚定引物通常在12碱基以上。在锚定引物和与基因特异配对的引物参与下，可以扩增带有同源多聚物尾巴的cDNA序列。与基因特异配对的引物通常是在未知序列中一小段已知序列的基础上设计合成的，而该已知序列一般是由纯化蛋白的部分氨基酸序列推测出来或从其他材料中获得的部分mRNA序列。,2019/3/14,第一节 目的基因的制备,71,4.4 反转录 PCR（RT-PCR）,RT-PCR，是将mRNA反转录与PCR技术相偶联的一种基因分离技术。通过mRNA反

37、转录，得到对应的cDNA，然后利用特定的PCR引物直接以反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增反应，获得大量所需的基因。 反转录可用总RNA或总poly(A)RNA为模板进行，反转录产物也无须转变成双链cDNA,即可进行PCR扩增。,2019/3/14,第一节 目的基因的制备,72,第一 连续RT-PCR( 两阶段单管式 ),由mRNA反转录成cDNA和DNA的PCR扩增是两个完全不同的酶催化反应过程，连续RT-PCR将这两种不同的酶催化过程放在一个管中连续反应，但在空间上两种反应仍是分开进行。在该程序中利用一种特制蜡烛冷却形成的蜡层，将两种反应混合物分开成上下两层，反应首先在较低的温度下进

38、 行反转录，由mRNA合成cDNA；当反应结束, 温度升高到95，使蜡层熔化，上下层反应液混合在一起，下层混合物中的TaqDNA聚合酶利用上层合成的cDNA作为模板进行PCR扩增。,2019/3/14,第一节 目的基因的制备,73,第二 长距离 RT-PCR( 两阶段双管式 ),长距离RT-PCR与连续RT-PCR都是使两种酶促反应分开进行，但长距离RT-PCR能扩增全长cDNA，得到更长的DNA 产物。 在反转录阶段，首先使模板引物融合，然后再加入反应混合物并预热，最后加逆转录酶，这样便分别满足各个步骤的最适条件。进行PCR循环时，首先进行95热起始，再加入Taq DNA聚合酶，采用双 sh

39、uttle PCR 程序延长合成时间，由此扩增出长达 46 kb的DNA片段。,2019/3/14,第一节 目的基因的制备,74,4.5 锅柄 PCR（panhandle PCR）,用PCR扩增未知序列，因为不能设计所需要的引物而难以实现。锅柄PCR就是为扩增未知序列而设计的一种策略。 如果一段未知序列处于已知序列的上游，那么可根据已知的3端序列设计引物而扩增出未知序列，如果未知序列位于已知序列下游则须将5端的已知序列拷贝到未知序列的下游，这样使未知序列的两侧都含有已知序列，据此可以扩增未知片段，也能从3，5两端测定已知基因的序列。,2019/3/14,第一节 目的基因的制备,75,锅柄 PC

40、R实施步骤,用内切酶消化环状dsDNA产生5黏末端线型DNA片段，用Klenow酶填平5黏末端，然后用BAP脱去5磷酸，避免自我环化。 合成一个与5末端碱基和已知基因的5端内部某个区域能互补的附加引物，与上述线性化片段的3端连接，5端由于脱磷而不能连接。,2019/3/14,第一节 目的基因的制备,76,将连接物变性后再冷却复性，其中一条单链DNA分子(负链)由于附 加引物而与互补区域以碱基配对形成锅柄状的链内二级结构，而正链的附加引物是不能互补的。 锅柄结构中出现一个龟缩的3端，它可作为引物进行 PCR 扩增，经变性成单链后而使未知区域的3，5两侧都带有完整的已知基因序列。,2019/3/1

41、4,77,以3 端的引物进行单向PCR扩增，合成另一条链，不过如果全部序列太长，则难以达到5端的已知区域，得不到全长片段。 变性后再次冷却生成链内二级结构，得到另一条链的模板，龟缩的3端同样可作引物进行PCR扩增而得到全长片段，其中未知基因处于中间，3、5 两侧是已知基因的全序列。 套式PCR: 用引物对(l)和(2)或(3)分别作外侧引物和内部引物可以扩增不同长度的DNA片段，其中包括完整的已知序列。,2019/3/14,78,第五章 目的基因的制备,第一节 目的基因的制备 第二节 目的基因的分离,2019/3/14,79,第二节 目的基因的分离,1 目的基因的功能克隆 2 序列克隆法 3

42、差别杂交及减法杂交技术 4 差示分析法 5 功能结合法 6 其他方法,2019/3/14,第二节 目的基因的分离,80,第二节 目的基因的分离,在基因文库中,不论是cDNA文库还是基因组DNA文库,含 目的基因的克隆子都只是数以万计的克隆子中的一个,究竟哪一个克隆子含有我们所要研究的目的基因？因此克隆一个基因的下一个步骤就是从基因文库中筛选分离出含有目的基因的特定克隆子。这个步骤可以依据待分离目的基因的有关特性,如基因的序列、功能、在染色体上的位置和转录产物mRNA等,建立相应的方法加以完成。,2019/3/14,81,第二节 目的基因的分离,1 目的基因的功能克隆筛选 2 序列克隆法筛选 3

43、 差别杂交及减法杂交技术筛选 4 差示分析法筛选 5 功能结合法筛选 6 其他筛选方法,2019/3/14,第二节 目的基因的分离,82,1 目的基因的功能克隆筛选法,1.1 根据特异蛋白分离目的基因 在基因工程发展的早期阶段，有关功能基因的分离与克隆多是在特异蛋白分离、纯化和测序的基础上完成的。这也是通常所说的目的基因的功能克隆策略。,基本过程是：,2019/3/14,第二节 目的基因的分离,83,1.2 功能互补法克隆基因,功能互补克隆技术，是利用被克隆的DNA片段与寄主细胞的染色体DNA在功能上有同源互补性来进行目的基因直接分离的。一种最简单的方式是，将大肠杆菌DNA的克隆片段“库”中的

44、重组DNA分子分别导入一种大肠杆菌营养缺陷型菌株的受体细胞，然后将此受体细胞涂布在一种缺少该菌株所需要的营养底物的基本培养基上结果只有那些获得了营养缺陷型互补基因的受体细胞才会长成转化子菌落。,2019/3/14,84,第二节 目的基因的分离,1 目的基因的功能克隆筛选 2 序列克隆法筛选 3 差别杂交及减法杂交技术筛选 4 差示分析法筛选 5 功能结合法筛选 6 其他筛选方法,2019/3/14,第二节 目的基因的分离,85,2 序列克隆法筛选,2.1 根据已知基因序列或同源基因序列分离目的基因 最直接方法是用核酸探针进行杂交筛选。 可先从DNA序列数据库中查找有关基因的序列，再用该基因序列

45、或其一部分作为探针筛选该基因的克隆； 在自然界的长期进化过程中，一些蛋白质的基因编码序列保持着高度的保守性，因此在生物的种、属之间，基因编码序列有着很高的同源性。如果某种生物的同源基因已被克隆，则可以利用该基因或其部分序列制备探针来筛选基因文库，再对阳性克隆进行测序，并与已知基因序列或同源性序列进行比较，最后经转化鉴定是否为待分离的基因。,2019/3/14,第二节 目的基因的分离,86,把滤膜放在平板上，将噬菌斑中的噬菌体颗粒影印到滤膜上，使噬菌体DNA结合在滤膜上。把滤膜放入含有放射性标记的探针的溶液中杂交。杂交后洗去膜上非结合的探针，经放射自显影确定。然后根据 X 线片上的放射性位点寻找

46、相应的噬菌斑，从而分离到与探针顺序互补的目的克隆。,基本过程图,2019/3/14,第二节 目的基因的分离,87,2.2 表达序列标签法分离目的基因,2.2.1概念 表达序列标签(expressed sequence tag,EST)是指基因序列中一段能特异地标记或表征基因的序列，通常它含有足够的结构信息以显示出该基因与其他基因的差异，长度一般为100500bp。利用EST寻找新基因的一种策略即为表达序列标签法(ESTs)。现该法已成为快速分离克隆新基因的一种有效手段。该房法研究的是被转录的基因序列。,2019/3/14,第二节 目的基因的分离,88,2.2.2 基本步骤,从组织特异性或细胞特异性的cDNA文库中随机挑选克隆，进行5 端和3 端部分序列(约 400bp)的测定。 通过对核苷酸序列数据库进行联机检索，检测出所测定序列及其对应的多肽氨基酸序列与基因库中已知的基因进行同源性比较。 可以通过基因文库的筛选或基因定位的方法分离目的基因。,2019/3/14,第二节 目的基因的分离,89,3 筛选目的基因片段的差别杂交及减法杂交技术,3.1差别杂交法(differential hybridization) 构建了基因文库后，如未有任何可供选择的探针进行筛选，或未有任何有关目的基因的核苷酸序列信息时，可以考虑采