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1、第五章 细胞的原代与传代培养,一、原代培养 概念：取自体内新鲜组织并置于体外条 件下生长的细胞在传代之前称为 原代培养。,原代培养技术的重要意义: 原代培养的最大优点是细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，具有二倍体的遗传性，而且大多数细胞表现出原来组织的特性。 利用原代培养做各种实验，如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验效果很好。 原代培养也是建立各种细胞系（株）必须经过的阶段。,原代培养,消化法：这种培养过程主要是采用无菌操作的方法，把组织（或器官）从动物体内取出，经酶消化处理，使分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。,消化法,贴块法,冷消化,温消化,一次性消化,
2、分次消化,贴块法,消化法,原代培养方法分类,93,分次消化,消化法的分类,解离释放细胞的方法,最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。 用酶学解离细胞法解离细胞是体外培养动物细胞时分散组织的基本方法，最常用的消化酶是胰蛋白酶和胶原酶两种。,动物细胞原代培养过程图,器材和液体的准备,细胞培养用的玻璃器材 培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒中，160，2小时干烤灭菌后备用 手术器材、瓶塞等 15磅，121，20分钟蒸气灭菌 MEM培养液、消化液、PBS液等 用滤器过滤后备用,方法与步骤（举例）,（1）动物处死：将出生23d乳鼠，用拉颈椎方法处死。腹部向上钉在蜡盘中，
3、用碘酒和酒精棉球擦拭腹部消毒。 （2）剪取心脏：在无菌条件下将心脏（心尖）取出，置于无菌培养皿中，用Hanks液洗涤1-2次去除血污；放入另一培养皿中，纵向剪开心脏，仔细去除心腔内血污后剪成1mm3大小的组织块，再并用Hanks液洗涤23次，直到液体澄清。,（3）消化及分散组织块：将上述清洗过的组织放入无菌三角烧瓶内，加入56倍量的0.1胰蛋白酶液（pH7.4 7.6），置37恒温磁力搅拌器上分次消化：每次消化8-10分钟。在超净台中吸出胰蛋白酶液于带盖离心管中，加入2滴血清终止消化。直到组织块基本消化完全。 各管配平后离心，收集细胞，无血清培养液洗2-3次后，将细胞悬液用两层灭菌纱布过滤至另
4、一烧杯中。,（4）计数与稀释：从过滤的细胞悬液中取出1ml滴于血细胞计数板上，按白细胞法进行计数；计数后用培养液稀释，稀释后的浓度一般以每毫升含30 50万个细胞为宜。 （5）分装与培养：将稀释好的细胞悬液分装于细胞培养瓶中，盖好瓶盖，在培养瓶上做好标记，置于37的CO2培养箱中培养。 （6）观察：逐日检查培养物是否污染，观察细胞生长情况。待细胞已基本长成致密单层时，即可进行传代培养。,外植块培养步骤图解,原代细胞培养结果,细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长 如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层,二、传代细胞培养,细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增
5、不同。在一代中，细胞培增36次 离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时，细胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止，如不及时分离传代培养，细胞将逐渐衰老死亡。传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或其他比率转移，接种到另一培养瓶的培养。贴壁培养细胞的传代通常是采用胰蛋白酶消化，把细胞分散成单细胞再传代，而悬浮型生长细胞则用直接传代法或离心法传代。,方法与步骤,（一）贴壁细胞传代培养 （1）选取生长良好的细胞，在超净工作台的酒精灯 旁，倒去瓶中的旧培养液，加入23ml的D- Hanks液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在 细胞表面的碎片(思考：还有什么作用？） （2）加入适量0. 0.25胰蛋白酶消化液，
6、室温消化，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液。,（3）用Hanks液洗涤1次，加入适量培养液，反复吹 打细胞，使其成细胞悬液。 （4）以1：2或1：3进行分装，并在培养瓶上做好标 记，注明代号、日期，轻轻摇匀， 37 CO2 培养箱培养。 （5）观察：细胞培养24h后，即可观察培养液的颜 色及细胞的生长情况。,（二）悬液细胞的传代培养 （1）取生长良好的细胞，在超净工作台用无菌吸管 把培养瓶中的细胞吹打均匀。 （2）转移到无菌的离心管中，盖紧胶盖，平衡后离 心（1 000r/min）5min。(区别贴壁传代) （3）在超净工作台中吸去上清液，加入适量新培养 液，用吸管吹打
7、细胞，制成悬液。 （4）以1：2或1：3进行分装，并在培养瓶上做好标 记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37 CO2培养 箱培养。 （5）观察：细胞培养24h后，即可进行观察。,传代细胞培养结果,一般情况，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上，24天就可在瓶内形成单层，需要再次进行传代,三、人体活检(或手术)材料 (1) 在准备以临床材料为实验材料时,要预先与临床外科医生和护士商量,并做好一切必要的准备工作。争取拿到的标本新鲜、无菌、少坏死等。 (2)与临床联系好手术时间后，立即做好如下准备工作：准备好1-2个贮有培养液和抗生素的标本收集瓶，将盖盖紧，保持无菌，瓶外贴上标签，写上工作人员名
8、字、地点和电话号码；将收集瓶送往医院，并与医生和护士讲清解取手术标本的部位及注意事项。,(3)标本放入收集瓶后，送出手术间，立即送往组织培养实验室。工作人员最好是等在手术间外。但有时手术时间难以掌握。则请护士将收集材料的瓶子盖好后，放入4冰箱，尽快打电话通知工作人员。 (4)取临床标本时，虽然尽可能做到无菌操作，但仍有污染可能性的存在。可选用抗生素类控制污染。如手术标本比较大（约200mg以上），可将其浸于70%酒精中约30-60秒，这样会减少表面污染而不损坏内部组织的结构和存活。不要用纱布包裹标本，纱布纤维易粘附在组织上。,需要注意的事项 整个取材过程中，都要注意保持组织的湿润，随时给组织块滴加一些培养液或平衡盐溶液。一般情况下，最好是使用冰冷的液体。 在剪碎或切割组织块时，尽量使用锋利的刀剪，防止以钝器对组织揉、捻、撕拉等而造成细胞损伤。 整个取材过程耗时越短越好。在万不得已的情况下，取材后也可将组织贮存在冷的(4)含平衡盐溶液(或其它缓冲盐溶液)的营养液中，最好不超过2448h(视不同组织类型而定)。,